[發明專利]一種聯合檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4和CA125的試劑盒及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711257970.X
• 申請日: 2017-12-04
• 公開（公告）號: CN108008132B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 劉承舉;劉向祎;路晟
• 申請（專利權）人: 北京惠中醫療器械有限公司;劉向祎
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/543;G01N33/535;G01N33/577
• 代理公司: 北京東方匯眾知識產權代理事務所(普通合伙) 11296
• 代理人: 張淑賢

1.一種聯合檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4和CA125的試劑盒，其特征在于，包括HE4抗體和CA125抗體聯合標記的磁微粒、酶標記物、化學發光底物液、顯色底物液；其中酶標記物由堿性磷酸酶標記的HE4抗體和硅烷化辣根過氧化物酶標記的CA125抗體組成；

所述化學發光底物液為0.2mol/L pH 9.7的Tris緩沖液溶液，所述Tris緩沖液溶液中還包括2.7mol/L的氯化鈉、0.08mmol/L的十六烷基三甲基氯化銨和2.6mmol/L的3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環乙烷二鈉鹽；

顯色底物液為pH 6.0±0.5醋酸鈉-檸檬酸緩沖溶液，其中醋酸鈉0.33mol/L，檸檬酸0.017mol/L，所述醋酸鈉-檸檬酸緩沖溶液還包括10％的甘油，0.06％的30％過氧化氫和用二甲基亞砜溶解的的四甲基聯苯胺，所述四甲基聯苯胺在緩沖溶液的終濃度為0.15g/L。

2.如權利要求1所述的聯合檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4和CA125的試劑盒，其特征在于，還包括校準品和洗滌緩沖液。

3.如權利要求1所述的聯合檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4和CA125的試劑盒，其特征在于，硅烷化辣根過氧化物酶由以下方法制備獲得，包括將辣根過氧化物酶加入叔丁基二甲基氯硅烷的N,N-二甲基甲酰胺溶液中得混合物溶液，攪拌反應得硅烷化辣根過氧化物酶。

4.如權利要求3所述的聯合檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4和CA125的試劑盒，其特征在于，所述叔丁基二甲基氯硅烷的N,N-二甲基甲酰胺溶液的濃度為3.02mg/ml；每1mg的辣根過氧化物酶中加入128μL叔丁基二甲基氯硅烷的N,N-二甲基甲酰胺溶液。

5.如權利要求3所述的聯合檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4和CA125的試劑盒，其特征在于，硅烷化辣根過氧化物酶制備過程中還包括首先對酶進行除鹽和濃縮，具體方法為：取辣根過氧化物酶，加入除鹽緩沖液，采用分子篩層析法進行除鹽，然后對除鹽后收集的辣根過氧化物酶進行離心濃縮至3～5mg/ml。

6.如權利要求3所述的聯合檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4和CA125的試劑盒，其特征在于，還包括對硅烷化辣根過氧化物酶進行純化與濃縮，具體方法為：采用分子篩層析法對混合物溶液攪拌反應后的產物進行分離純化，除去未反應的殘留物，將純化后的硅烷化辣根過氧化物酶進行離心濃縮至3～5mg/ml。

7.一種如權利要求1所述的聯合檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4和CA125的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下操作步驟：

1)制備HE4抗體和CA125抗體聯合標記的磁微粒：包括含有HE4抗體和CA125抗體的溶液中加入活化后的羧基磁珠，混合偶聯反應后，對反應后的磁珠進行封閉，即得所述的HE4抗體和CA125抗體聯合標記的磁微粒；

2)制備酶標記物：A：制備堿性磷酸酶標記的HE4抗體：將活化除鹽后的HE4抗體與活化除鹽后的堿性磷酸酶混合偶聯反應，即得堿性磷酸酶標記的HE4抗體；

B：制備硅烷化辣根過氧化物酶標記的CA125抗體：將除鹽后的辣根過氧化物酶加入叔丁基二甲基氯硅烷溶液中反應制得硅烷化辣根過氧化物酶，將硅烷化辣根過氧化物酶活化除鹽后與活化除鹽的CA125抗體混合偶聯反應，即得硅烷化辣根過氧化物酶標記的CA125抗體；

C：將步驟A制備的堿性磷酸酶標記的HE4抗體與硅烷化辣根過氧化物酶標記的CA125抗體混合，即得酶標記物；

3)制備化學發光底物液和顯色底物液；

4)取步驟1)制備的HE4抗體和CA125抗體聯合標記的磁微粒、步驟2)制備的酶標記物、步驟3)制備的化學發光底物液和顯色底物液，組裝成試劑盒，即完成。