[發明專利]魚類卵巢組織石蠟切片的制作方法

在審

• 申請號: 201711256841.9
• 申請日: 2017-12-04
• 公開（公告）號: CN107917832A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 陳劍杰;曹謹玲;羅永巨;高榮琨
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 太原華弈知識產權代理事務所14108
• 代理人: 李毅

技術領域

本發明屬于生物組織石蠟切片制作技術領域，具體涉及到一種魚類卵巢組織石蠟切片的制作方法。

背景技術

石蠟切片由于操作簡單、價格低廉的特點，一直是是組織學顯微觀察中應用最為廣泛的一種制作切片的方法。作為傳統的生物學研究技術，石蠟切片不但可以進行正常組織細胞形態學方面的觀察，而且在病理學、免疫學、細胞原位核酸分子雜交、形態計量領域方面應用也非常廣泛。石蠟切片要經過固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟、染色、透明以及封片等步驟來使其組織細胞保持原有的結構并可以清楚觀察和分析。而魚類卵巢的卵黃比較豐富，導致制作切片很不容易，按照過去的一般方法，切片易碎，切片中間易形成空洞，使顯微觀察看不清楚結構，其他的免疫和分子生物學分析無法進行。因此，如何對現有石蠟切片制作方法進行改進，解決魚類卵巢組織切片制作過程中存在的問題，是本領域亟待解決的問題。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術存在的一些缺陷，提供一種能夠改善和提高魚類卵巢石蠟切片質量的制作方法，該制作方法可以使是魚類卵巢組織和細胞結構清楚完整，為進一步的免疫學和分子生物學和形態計量方面的分析提供高質量的組織切片。

本發明的魚類卵巢組織石蠟切片的制作方法，步驟如下：

（1） 材料取樣 魚卵巢組織取樣材料的體積為：3.6-4 mm×3-3.3mm×3-3.3mm；

（2）組織固定 魚卵巢組織經Zamboni’s固定液固定8小時后，流水沖洗6小時，洗去其固定液；

（3）脫水及透明 將（2）處理的組織依次用下列試劑處理：50%乙醇10min、70%乙醇15min、80%乙醇15min、95%乙醇90min、95%乙醇90min、無水乙醇2份+正丁醇1份60 min，無水乙醇1份+正丁醇1 份60 min、正丁醇45min、正丁醇45min；

（4）浸蠟 將經（3）處理過的組織樣放入熔化好石蠟的浸蠟盒中進行浸蠟，依次用下列試劑處理：正丁醇1份+:石蠟1份30min、石蠟90min、石蠟90min

（5）石蠟包埋 將經（4）處理過的組織樣放入熔化好石蠟的包埋盒中進行包埋，等石蠟自然冷卻凝固后，把包埋好的蠟塊從盒中取出修整；

（6）切片 將（5）修整好的蠟塊粘牢到準備好的小木塊上，然后固定于切片機上，與切片刀調成平行，切成蠟帶；

（7）貼片和烤片 在（6）準備的切片中，選擇有完整組織樣的蠟帶，蠟帶光滑面向下，放入40~42℃水浴箱中展片后，用多聚賴氨酸處理過的載玻片從水中撈出，使組織樣整齊排列在載玻片上，在切片作好標記，放置在切片架上，烘箱45℃烤片5.5-6h，自然冷卻；

（8）脫蠟 將放有載玻片的切片架放入染色缸中，依次用下列試劑處理：二甲苯10min、二甲苯10min；

（9）復水 將經（8）處理的切片依次用下列試劑處理：無水乙醇2min、無水乙醇2min、95%乙醇3min、80%乙醇3min、70%乙醇3min、自來水緩慢沖洗、蒸餾水2min；

（10）染細胞核 將配置好的Harris氏蘇木素液倒入染色缸，室溫下把經（9）處理的切片放入染色缸10~20min，然后依次用下列試劑處理：自來水緩慢沖去浮色1min、1%鹽酸酒精分化10s、1%氨水10 s、蒸餾水1~2min；

（11）染細胞質 將經（10）染完細胞核的切片依次用下列試劑處理：伊紅染液5min、自來水緩慢沖洗浮色30s；

（12）脫水 將經（11）的切片依次用下列試劑處理：70%乙醇30s、80%乙醇30s、95%乙醇2min、無水乙醇2min、無水乙醇2min；

（13）透明 將經（12）的切片依次用下列試劑處理：二甲苯5min、二甲苯5min；

（14）封固 將經（13）透明好的切片晾干后，滴中性樹膠，從一側慢慢放下蓋玻片。晾干后，用刀片刮去多余的樹膠即可。

所述的Zamboni’s固定液由下列試劑配成，多聚甲醛25g，飽和苦味酸 200ml，Karasson-Schwlt’s磷酸鹽緩沖液至1000ml。

所述的石蠟指熔點為52~56℃的鱗片狀切片石蠟。

所述的Harris氏蘇木素液由下列試劑配成，蘇木素2g，無水乙醇30ml，硫酸鋁鉀40g，蒸餾水500ml，紅色氧化汞1.5g，冰醋酸15ml。