[發明專利]一種準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法

有效

• 申請號: 201711249372.8
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN108034691B
• 公開（公告）日: 2021-08-06
• 發明（設計）人: 李升康;張新旭;張明;張旭昇;孫再橋
• 申請（專利權）人: 汕頭大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭;張澤思

1.一種準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)配制ACD抗凝劑，調節pH至4.6，高壓蒸汽滅菌后在低溫中保存；

(2)無脊椎動物消毒，重復多次；

(3)在無脊椎動物合適部位抽取血淋巴，迅速與ACD抗凝劑混合；

(4)用含有5μm孔徑濾膜過濾，收集濾液；

(5)用含有0.2μm孔徑濾膜過濾，將濾膜轉移至干凈的培養皿中；

(6)避光向濾膜滴加熒光染液染色，移除熒光染液后滴加甘油溶液；

(7)熒光顯微鏡觀察計數，根據如下公式計算血淋巴微生物的豐度：

2.根據權利要求1所述準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，步驟(1)所述配制ACD抗凝劑配方為，氯化鈉450mM，葡萄糖100mM，檸檬酸26mM，檸檬酸鈉30mM，調節pH為4.6，在1.05kg/cm²壓力下用121℃的蒸汽滅菌20min后在4℃中保存。

3.根據權利要求1所述準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，步驟(3)所述無脊椎動物包括擬穴青蟹，凡納濱對蝦或葡萄牙牡蠣的一種或多種。

4.根據權利要求1或3所述準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，所述無脊椎動物抽取血淋巴的部位如下：擬穴青蟹為其第二、三步足基節膜處，凡納濱對蝦為其腹血竇，葡萄牙牡蠣為其閉殼肌。

5.根據權利要求1所述準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，步驟(3)所述ACD抗凝劑的量與血淋巴的量為體積比1:1。

6.根據權利要求1所述準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，步驟(4)所述收集濾液為200μL。

7.根據權利要求1所述準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，步驟(6)所述熒光染液為Green I熒光染液，配制如下：1:40v/vGreenI溶于1×Tris-EDTA buffer。

8.根據權利要求1所述準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，步驟(6)所述甘油溶液為體積分數10％的甘油溶液。

9.根據權利要求1所述準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，步驟(6)所述熒光染液滴加量為0.2μL/mm²，染色時間為20min，甘油溶液滴加量為0.05μL/mm²。

10.根據權利要求1所述準確計數無脊椎動物血淋巴中微生物的豐度的方法，其特征在于，步驟(7)所述熒光顯微鏡觀察計數時使用1000倍熒光顯微鏡，每張濾膜計數200個視野。