[發明專利]一種純化蛋白的方法以及試劑盒

有效

• 申請號: 201711246913.1
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN108264547B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 薛彤彤;肖亮;鄧春;樓俊文;劉立平;成裕;王利春;王晶翼
• 申請（專利權）人: 四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司
• 主分類號: C07K14/52
• 分類號: C07K14/52;C07K1/16;C07K1/18;C07K1/22;C07K1/34;C07K1/113;C07K1/36;A61K38/19;A61P7/04
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 劉海羅

本發明屬于生物化學和發酵工程領域，涉及一種純化蛋白的方法以及試劑盒。具體地，所述純化蛋白的方法，包括將蛋白包涵體的復性產物進行層析的步驟。本發明的方法純化蛋白的復性率高，收率高，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物化學和發酵工程領域，涉及一種純化蛋白的方法以及試劑盒。具體地，所述蛋白為血小板生成素模擬肽或其融合蛋白。

背景技術

特發性血小板減少性紫癜(ITP)是一種常見的出血性疾病，其患者有很大的出血風險。2008年8月，美國FDA批準羅米司亭(含有血小板生成素模擬肽)上市，用于治療特發性血小板減少性紫癜。羅米司亭產生自大腸埃希桿菌，系利用重組DNA技術制成的能刺激血小板生成的Fc肽融合蛋白，包含2個相同的單鏈亞單元，每個單鏈包含IgG Fc區和血小板生成素(thrombopoietin，TPO)模擬肽，分子量約為59kDa，其中Fc段可有效延長藥物半衰期，而血小板生成素模擬肽可與巨核祖細胞上的血小板生成素受體結合，使其活化，經由細胞內信號傳導促進血小板生成。由于該藥物同TPO無同源性，不產生抗體，耐受性好，且藥效顯著，被廣泛用于ITP患者。羅米司亭的結構式如下面的式A所示，其中TMP表示血小板生成素模擬肽IEGPTLRQWLAARA(SEQ ID NO:1)。

該血小板生成素模擬肽多為原核發酵以包涵體的形式表達，需要經過變復性等復雜工藝制備，工藝大致為菌體破碎、包涵體洗滌、變性、復性、層析純化。現有生產工藝由于復性率低，且相關雜質去除率低，導致生產成本高、產品純度低，不適宜工業化生產。例如中國專利公開CN102321168報道了一種制備血小板生成素模擬肽的方法，包含以下步驟：將含有血小板生成素模擬肽基因的大腸桿菌工程菌高密度發酵后，將菌體超聲破碎，尿素裂解，復性，調pH，經過親和層析、陽離子層析、分子篩層析三步層析得到血小板生成素模擬肽。其復性率為30％－40％，純化收率為每升發酵液可得血小板生成素模擬肽300mg。

然而，該方法存在復性率低(30％－40％)，收率低(每升僅得到成品300mg)的缺點。另外，該工藝采用分子篩層析來去除小分子，但分子篩層析對裝柱高度和柱效以及上樣量要求嚴格，多在實驗室階段使用，并不適于工業生產。另外當蛋白電荷變異超過一個pH單位時，會影響藥物的組織分布及藥代動力學，因此仍需提高純度，改善其組織分布及藥代動力學。

因此，尚需要開發新的針對血小板生成素模擬肽的蛋白純化工藝。

發明內容

本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，得到了一種純化血小板生成素模擬肽或其融合蛋白的方法。本發明人驚奇地發現，在血小板生成素模擬肽或其融合蛋白包涵體的復性產物的層析處理中，當采用羥基磷灰石層析(特別是不采用分子篩層析)時，得到的蛋白的收獲量顯著提高，蛋白的活性和純度亦非常高。進一步地，本發明還優化了蛋白包涵體復性之前的預處理工藝，顯著地提高了復性率。由此提供了下述發明：

本發明的一個方面涉及一種純化蛋白的方法，包括將蛋白包涵體的復性產物進行層析的步驟，其中，

所述蛋白為血小板生成素模擬肽或其融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有一個或多個血小板生成素模擬肽；優選地，所述融合蛋白包含2、3、4、5或6個血小板生成素模擬肽；

所述層析包括羥基磷灰石層析；

其中，所述血小板生成素模擬肽長度為9－16個氨基酸(例如9、10、11、12、13、14、15或16個氨基酸)，并且包含下面的式I所示的肽段：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

式I

其中，

X1選自谷氨酸、天門冬氨酸、賴氨酸和纈氨酸；

X2選自甘氨酸和丙氨酸；

X3選自脯氨酸；