[發明專利]一種純化蛋白的方法以及試劑盒

有效

• 申請號: 201711246913.1
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN108264547B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 薛彤彤;肖亮;鄧春;樓俊文;劉立平;成裕;王利春;王晶翼
• 申請（專利權）人: 四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司
• 主分類號: C07K14/52
• 分類號: C07K14/52;C07K1/16;C07K1/18;C07K1/22;C07K1/34;C07K1/113;C07K1/36;A61K38/19;A61P7/04
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 劉海羅

1.一種純化蛋白的方法，包括將蛋白包涵體的復性產物進行層析的步驟，其中，

所述蛋白為血小板生成素模擬肽融合蛋白；所述融合蛋白為血小板生成素模擬肽與人IgG Fc的融合蛋白；所述人IgG Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述蛋白如下面的式II所示：

其中，

TMP表示血小板生成素模擬肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示；所述層析為親和層析、陰離子層析和羥基磷灰石層析，所述層析不包括分子篩層析和/或陽離子層析；

所述層析的步驟為將蛋白的復性產物依次進行親和層析、陰離子層析和羥基磷灰石層析；

其中，所述親和層析使用選自如下的親和層析柱：

Mabselect或Mabselect sure；

所述陰離子層析使用如下的陰離子層析柱：

Q Sepharose HP；

所述羥基磷灰石層析選用I型陶瓷羥基磷灰石；

所述蛋白復性液包括40－60mM Tris，40－400mM Arg，1－5mM氧化還原對，0.5－2mMEDTA，1－2M尿素的溶液，pH為7.0－9.0；

所述純化方法還包括在蛋白復性之前，將蛋白包涵體的變性產物進行透析或超濾的步驟；

所述透析或超濾的截留分子量范圍是5－20kD；

所用透析液的pH為2.5－3.5；

以及透析時間為10－40小時；

所述純化方法還包括在所述透析或超濾之后，將透析截留產物或超濾截留產物進行氧化生成二硫鍵的步驟；其中，通過加入選自胱胺、氧化性谷胱甘肽和胱氨酸的任意一種或者幾種進行氧化生成二硫鍵。

2.根據權利要求1所述的純化方法，其中，所述透析或超濾的截留分子量范圍是8－15kD。

3.根據權利要求1所述的純化方法，其中，所述透析液的pH為2.7－3.2。

4.根據權利要求1所述的純化方法，其中，所述透析液為HCl溶液。

5.根據權利要求1所述的純化方法，其中，所述透析時間為15-30小時。

6.根據權利要求1～5任意一項所述的純化方法，其中，所述羥基磷灰石層析包括下述步驟：

a)用平衡緩沖液平衡羥基磷灰石層析柱；

b)將含有目的蛋白的樣品上樣；

c)用洗脫緩沖液進行梯度洗脫。

7.根據權利要求6所述的純化方法，其中，所述步驟a)中的平衡緩沖液為磷酸緩沖液。

8.根據權利要求6所述的純化方法，其中，所述步驟c)中的洗脫緩沖液為含有NaCl的磷酸緩沖液。

9.根據權利要求6所述的純化方法，其特征在于如下的(1)－(4)項中的任意一項或者多項：

(1)步驟a)中，所述平衡緩沖液為pH為6.0－7.0的10－20mM磷酸緩沖液；

(2)步驟b)中，上樣量為5－20mg蛋白/ml填料；

(3)步驟c)中，所述洗脫緩沖液為pH為6.0－7.0的含0.5－1.5MNaCl的10－20mM磷酸緩沖液；

(4)步驟c)中，洗脫體積為10－25倍柱體積，收集第二個洗脫峰。

10.一種制備蛋白的方法，其包括權利要求1至9中任一權利要求所述的純化方法。