[發明專利]一種基于混合生物樣本的酰基肉堿大規模定性方法

有效

• 申請號: 201711246815.8
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN109870535B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 許國旺;于迪;周麗娜
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明公開了一種基于混合生物樣本的酰基肉堿大規模定性方法。針對不同類型的生物樣本(血，尿，組織)，采用乙腈/水作為提取劑，渦旋(血，尿)/珠打研磨(組織)作為提取方法，離心取上清液進行真空冷凍干燥后，用乙腈/水復溶并混合，采用超高效液相色譜?組合型四極桿離子阱質譜聯用儀進行分析。基于標樣得到的特征子離子和中性丟失，篩選出母離子，進行平行反應監測模式檢測。本發明方法檢測樣本得到的代謝物種類豐富，大大增加了一次分析可定性出的酰基肉堿數目。本發明方法具有前處理簡單，定性可靠，酰基肉堿結構信息獲取充分等優點。

技術領域

本發明涉及分析化學領域和疾病代謝組學領域，是一種基于混合生物樣本采用平行反應監測模式定性和色譜保留時間預測的酰基肉堿大規模定性方法。

背景技術

肉堿的化學結構是L-3-羥基-4-三甲基氨基丁酸。在生物體內，長鏈脂肪酸在線粒體膜上的轉移酶的作用下，從酰基輔酶A轉移到肉堿生成酰基肉堿。酰基肉堿能調節脂肪酸代謝，參與支鏈氨基酸代謝，是一類重要的內源代謝物，與先天性遺傳代謝病，糖尿病等多種疾病相關。酰基肉堿的代謝輪廓分析對相關疾病的篩查診斷，機理研究有重要意義。然而目前從生物樣本中定性出的酰基肉堿種類卻非常有限。因此，開展大規模的酰基肉堿定性方法是十分必要的。

目前已有的酰基肉堿定性方法，為了提高酰基肉堿的覆蓋度，采用了SPE富集，衍生化，二維色譜，細內徑色譜柱等手段。而這些方法存在前處理繁瑣，流路復雜，分析時間長等缺點。已有的定性手段分為標樣定性和單一離子對結合保留時間定性兩種，前者大大限制了鑒定出的酰基肉堿數目，后者定性的準確性較差。綜上，在不受標樣限制的前提下，提高定性可靠性是目前的難點問題。

本發明中采用了混合健康人血樣、尿樣，小鼠組織的樣本，大大提高了樣本中酰基肉堿的覆蓋度，且前處理簡單；采用了高分辨質譜平行反應監測模式對樣品進行分析，一方面提高了靈敏度且不增加分析時間，另一方面得到的二級碎片信息全面且均為精確質量數，大大提高了定性的準確性，也擺脫了標樣不足的限制。至今尚無將本發明所述方法應用于代謝組學中酰基肉堿大規模定性的報道。

發明內容

本發明為了實現酰基肉堿大規模定性，建立了基于混合生物樣本，利用質譜平行反應監測模式和色譜保留時間預測的定性方法。該方法前處理簡單且樣品中含有的代謝物豐富；采用平行反應監測模式，具有靈敏度高、定性準確且不受標樣限制，信息獲取全面等優點。

本發明采用的具體技術方法如下：

(1)吸取50-100μL正常人的混合血樣/尿樣置于1.5mL離心管中；加入200-400μL乙腈，渦旋30-60s；稱取小鼠的肝組織5-10mg±0.5mg置于2mL離心管中，依次加入氧化鋯小球，500-1000μL體積比為4:1的乙腈/水，采用混合研磨儀在20-30Hz的條件下研磨提取1-2min，重復兩次；將上述的血，尿，組織提取后的樣品放入離心機中，在4℃，13000-15000rpm條件下離心10-15min；取離心之后的上清液，其中血樣225-450μL，尿樣230-460μL，組織210-430μL，置于1.5mL離心管中；放入真空冷凍干燥機中，在4℃下凍干3-4h，凍干樣本封好備用。

(2)血、尿、組織凍干樣本中分別加入50μL體積比為1:3的乙腈/水，其中含9種氘代內標，乙酰肉堿-d3，丁酰肉堿-d3，己酰肉堿-d3，辛酰肉堿-d3，癸酰肉堿-d3，十二酰基肉堿-d3，十六酰基肉堿-d3，3-羥基異戊酰肉堿-d3，3-羥基-9-十六碳烯酰基肉堿-d3，內標物的濃度均為0.1μg/ml；渦旋至完全溶解后，置于離心機在4℃，13000-15000rpm條件下離心10-15min，取上清液，渦旋混合待分析。

(3)采用超高效液相色譜-組合型四極桿離子阱質譜聯用儀的數據依賴監測-平行反應監測遞進式的信息采集方案進行樣本分析；