[發明專利]一種基于混合生物樣本的酰基肉堿大規模定性方法

有效

• 申請號: 201711246815.8
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN109870535B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 許國旺;于迪;周麗娜
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種基于混合生物樣本的酰基肉堿大規模定性方法，其特征在于：

（1）分別將血樣、尿樣采用乙腈作為提取劑，以渦旋方式提取；組織樣采用乙腈/水作為提取劑，以珠打研磨方式提取；分別離心取上清液進行真空冷凍干燥，得凍干樣本；

（2）血、尿、組織凍干樣本分別用乙腈/水復溶，混合；

（3）采用超高效液相色譜-組合型四極桿離子阱質譜聯用儀分層采集信息，即第一步數據依賴監測模式采集二級質譜信息，篩選對應的酰基肉堿母離子；第二步擴展酰基肉堿母離子種類后，用平行反應監測模式采集二級質譜信息，確認酰基肉堿結構；

（4）根據二級質譜信息，實際色譜保留時間和預測油水分配系數ClogP的對應關系，對生物樣本中的酰基肉堿進行檢測和結構鑒定；

（5）預測樣品中未檢測到的酰基肉堿的保留時間，進一步擴展酰基肉堿種類；

步驟（3）中根據數據依賴模式-非靶向掃描得到的二級質譜信息，設置質量精度為±10ppm，篩選出能產生3個特征子離子m/z 60.0808、m/z 85.0284、m/z144.1019和一個中性丟失m/z 59.0735的母離子；通過文獻調研和數據庫檢索，基于同系物之間相差一個或多個亞甲基，擴展母離子的數目，再對母離子進行平行反應監測模式的靶向分析；

步驟（4）中根據色譜保留行為，二級質譜信息對酰基肉堿進行鑒定，滿足以下條件的代謝物定性為酰基肉堿： ①母離子質量精度設置為±5ppm；②子離子質量精度設置為±10ppm，必須含有m/z 85.02841的特征子離子，且該子離子的色譜保留行為與母離子相同；③ 二級質譜中需包含子離子m/z 60.0808， m/z144.1019及中性丟失m/z 59.0735中的至少2個；定性為酰基肉堿的代謝物進一步根據二級質譜信息，推測酰基肉堿的酰基鏈官能團和可能的結構；

步驟（5）中基于已定性出的酰基肉堿，針對每一系列的同系物，將其碳數和保留時間擬合成線性函數；根據同系物保留規律，將未檢測到的同系物碳數代入該擬合函數，預測樣品中其保留時間，擴展酰基肉堿數目。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中吸取50-100 μL正常人的混合血樣/尿樣置于1.5 mL 離心管中；加入200-400 μL乙腈，渦旋30-60 s；稱取小鼠的肝組織5-10 mg置于2 mL 離心管中，依次加入氧化鋯小球，500-1000 μL體積比為5:1-3:1的乙腈/水，采用混合研磨儀在20-30 Hz的條件下研磨提取1 -2 min，重復兩次；將上述的血、尿、組織提取后的樣品放入離心機中，在3-5 ℃，13000-15000 rpm條件下離心10-15 min；取離心之后的上清液，其中血樣225-450 μL，尿樣230-460 μL，組織210-430 μL，置于1.5 mL離心管中；放入真空冷凍干燥機中，在3-5 ℃下凍干3-4 h，凍干樣本封好備用。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（2）中凍干后的樣品分別加入50 μL 體積比為1:2-1:4的乙腈/水；其中含9種氘代內標，乙酰肉堿-d3，丁酰肉堿-d3，己酰肉堿-d3，辛酰肉堿-d3，癸酰肉堿-d3，十二酰基肉堿-d3，十六酰基肉堿-d3，3-羥基異戊酰肉堿-d3，3-羥基-9-十六碳烯酰基肉堿-d3，內標物的濃度均為0.05-0.15 μg/ml；渦旋至完全溶解后，置于離心機，在3-5 ℃，13000-15000 rpm條件下離心10-15 min，取上清液，渦旋混合待分析。