[發明專利]一種從微生物發酵液中分離純化胞二磷膽堿鈉的方法

在審

• 申請號: 201711246729.7
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN109836468A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 時銘;王欣彤
• 申請（專利權）人: 蘇州華賽生物工程技術有限公司
• 主分類號: C07H19/10
• 分類號: C07H19/10;C07H1/06
• 代理公司: 蘇州廣正知識產權代理有限公司 32234
• 代理人: 孫茂義

本發明公開了一種從微生物發酵液中分離純化胞二磷膽堿鈉的方法，包括如下步驟：（1）胞二磷膽堿發酵液，經加熱，絮凝，固液分離得到清液，清液經超濾、納濾連續式預處理得到預處理液；（2）將預處理液上強堿性陰離子交換樹脂預柱進行預處理，流出液經強堿性陰離子交換樹脂純化柱吸附，再經氯化鈉溶液洗脫，將高純度洗脫液合并后，經過減壓濃縮、醇沉結晶得到胞二磷膽堿鈉粗品；（3）將胞二磷膽堿鈉粗品活性炭脫色、過濾、濃縮、醇沉結晶、真空干燥得到胞二磷膽堿鈉成品，其品質好、收率高、成本低、污染少。

技術領域

本發明屬于生物化學分離技術領域，具體地，涉及一種從微生物發酵液中分離純化胞二磷膽堿鈉的方法。

背景技術

胞二磷膽堿鈉（圖1）為核苷衍生物，可以通過降低腦血管阻力，增加腦血流而促進腦物質代謝，改善腦循環。另外，可增強腦干網狀結構上行激活系統的機能，增強錐體系統的機能，改善運動麻痹，故對促進大腦功能的恢復和促進蘇醒，有一定作用。臨床用于急性顱腦外傷和腦手術后的意識障礙。

關于胞二磷膽堿鈉的生產，主要有（1）化學合成；（2）酶促合成；（3）微生物發酵合成轉化等幾種。對于胞二磷膽堿鈉的分離純化，國內外報道的比較少，傳統的分離純化工藝不僅工序繁雜、收率低、分離成本比較高，而且對環境的污染較大。張劍等(CN101130797A)提出將轉化液上碳柱，純水沖洗碳柱，再用乙醇-堿溶液洗脫，收集，再進行大孔離子交換樹脂純化。這種碳柱與交換柱結合的形式，碳柱死吸附嚴重導致收率低，碳柱洗脫、樹脂再生產生大量的廢水，污水處理量極大。胡建榮（CN102010454A）提出，使用色譜柱或者硅膠柱來進行胞磷酸膽堿鈉的純化，成本較高，規模化生產難以實現，所得產品純度偏低，均在98%以下，洗脫液中大量有機溶劑回收困難。藤原好孝等(日本特公昭62-16497)對化學法合成的CDP-choline溶液，使用強酸性離子交換樹脂RHPK-25.4-60(H型)柱和弱堿性離子交換樹脂RWA-30(OH型)柱兩道工序分離純化，HPLC純度可達98％，收率未見報道。

這些方法都實現了胞二磷膽堿鈉的分離，但均存在工藝復雜、產品得率偏低、產生大量廢水固渣，環保壓力大、分離成本高、等若干個缺點。

本發明中的胞二磷膽堿鈉來源于特定大腸桿菌發酵所得胞二磷膽堿鈉發酵液（CDP-choline發酵液）。通過基因工程手段改造大腸桿菌（K12系）獲得以葡萄糖和氯化膽堿為底物合成胞二磷膽堿的工業菌株，通過增殖，誘導，底物的流加，產物濃度中控等發酵、反應得到胞二磷膽堿鈉的發酵液。此發酵液中，存在著大量的菌體與色素，以及沒有被轉化完的底物氯化膽堿、無機磷酸鹽、硫酸鹽、銨鹽、鈣、鎂和葡萄糖等，另外還有細胞自溶產生的雜質：蛋白和核酸等化合物。雜質成分要遠遠多于化學合成或者酶促合成，分離難度極大。本發明不僅成功實現了雜質多分離難的問題，還主要具備環保壓力小、低成本、高品質、高得率等優點。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，從品質、收率、成本、污染程度等綜合考慮，提供一種品質好、收率高、成本低、污染少的從大腸桿菌發酵液中分離純化胞二磷膽堿鈉的方法。

技術方案：本發明提供了一種從微生物發酵液中分離純化胞二磷膽堿鈉的方法，包括以下步驟：

（1）胞二磷膽堿大腸桿菌發酵液經加熱，絮凝，固液分離得到清液，清液經超濾、納濾連續式預處理得到預處理液；

（2）預處理液通過預柱進行預處理，流出液經純化柱吸附，再經氯化鈉溶液洗脫，高純度洗脫液合并后經減壓濃縮、醇沉結晶，得到胞二磷膽堿鈉粗品；

（3）將胞二磷膽堿鈉粗品溶解，經活性炭脫色后過濾，濾液經減壓濃縮，醇沉結晶后真空干燥，得到胞二磷膽堿鈉成品。