[發(fā)明專(zhuān)利]一種人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法和干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711243178.9
• 申請(qǐng)日: 2017-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109852583A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董明珠;李霞云;潘新;劉世紅;盧家堃
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京世紀(jì)勁得生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0775;C40B50/06
• 代理公司: 北京愛(ài)普納杰專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

1.一種人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法至少包括脂肪干細(xì)胞的原代操作步驟，培養(yǎng)方法使用的培養(yǎng)基由DMEM-F12培養(yǎng)基中添加終濃度為1-20％的胎牛血清、1-100ng/ml的bFGF和1-100ng/ml的EGF制成。

2.如權(quán)利要求1所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述DMEM-F12培養(yǎng)基中的胎牛血清添加終濃度為10％、bFGF為10ng/ml、EGF為10ng/ml。

3.如權(quán)利要求1所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪原代操作步驟包括破碎、清洗、消化、分離、培養(yǎng)步驟。

4.如權(quán)利要求3所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪原代操作步驟包括：

破碎，將脂肪組織置于離心管中后用剪刀剪碎，用齒鑷剔除肉眼可見(jiàn)的結(jié)締組織，然后離心；

清洗，吸出脂肪，用PBS清洗，清洗后離心，取上層的脂肪層；

消化，用Ⅰ型膠原酶37℃搖床消化；用與消化液等量的含10％FBS的低糖DMEM完全培養(yǎng)基終止消化并輕輕吹打；

分離，離心，移除脂肪層及脂肪組織層，吸取下面的細(xì)胞，用網(wǎng)篩過(guò)濾；收集濾液于離心管中，離心；

培養(yǎng)，棄去上層脂質(zhì)層及中間液體層，用所述培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后，以1×10⁵～1×10⁷細(xì)胞/瓶的密度接種于T75培養(yǎng)瓶中，加入所述培養(yǎng)基，于37.5℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5.如權(quán)利要求3所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪原代操作步驟包括：

破碎，將脂肪組織置于50ml離心管中后用剪刀剪碎，用齒鑷剔除肉眼可見(jiàn)的結(jié)締組織，然后1500r/min，離心5min；

清洗，吸出脂肪，用與脂肪組織等量的PBS清洗兩次，清洗后1500rpm/min離心5min，每次清洗完畢后吸取上層的脂肪層；

消化，用與脂肪組織等體積的0.15％Ⅰ型膠原酶37℃搖床消化30min，200r/min；用與消化液等量的含10％FBS的低糖DMEM完全培養(yǎng)基終止消化并輕輕吹打；

分離，1500rpm/min離心5min，移除脂肪層及脂肪組織層，吸取下面的細(xì)胞，用200目網(wǎng)篩過(guò)濾；收集濾液于50ml離心管中，1500rpm/min離心5min；

培養(yǎng)，棄去上層脂質(zhì)層及中間液體層，用所述培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后，以1×10⁶細(xì)胞/瓶的密度接種于T75培養(yǎng)瓶中，每瓶加入所述培養(yǎng)基10ml，于37.5℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6.如權(quán)利要求3所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，還包括傳代操作步驟，所述傳代操作步驟包括清洗、消化、清洗、離心、培養(yǎng)步驟；

所述傳代操作步驟使用的培養(yǎng)基由DMEM-F12培養(yǎng)基中添加終濃度為10％的胎牛血清、10ng/ml的bFGF和10ng/ml的EGF制成。

7.如權(quán)利要求6所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述傳代操作步驟包括：

清洗，取原代培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗；

消化，加入胰酶，37℃消化；

清洗，細(xì)胞懸液用PBS清洗；

離心，合并洗滌液離心；

培養(yǎng)，倒掉上清，用新鮮的所述培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞接種量為1×10⁵～1×10⁷每T75培養(yǎng)瓶；37℃，5％CO₂，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。