[發明專利]一種人脂肪干細胞的分離培養方法和干細胞庫的構建方法

在審

• 申請號: 201711243178.9
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN109852583A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 董明珠;李霞云;潘新;劉世紅;盧家堃
• 申請（專利權）人: 北京世紀勁得生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C40B50/06
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

本發明公開了一種人脂肪干細胞的分離培養方法，培養基為DMEM?F12培養基中添加終濃度為1?20％的胎牛血清、1?100ng/ml的bFGF和1?100ng/ml的EGF，包括脂肪原代操作步驟，所述脂肪原代操作步驟包括破碎、清洗、消化、分離、培養步驟；還包括傳代操作步驟，所述傳代操作步驟包括清洗、消化、清洗、離心、培養步驟。本發明的人脂肪干細胞的分離培養方法，培養基配方組分簡單，分離培養方法中培養時間短，生長速度快，干細胞純度高，培養過程中沒有出現干細胞分化現象。

技術領域

本發明屬于干細胞領域，具體涉及一種人脂肪干細胞的分離培養方法和干細胞庫的構建方法。

背景技術

2001年利用抽脂術從人的脂肪組織懸液中第一次分離獲得了多向分化干細胞。由于從脂肪組織提取干細胞取材容易，且可以把抽脂術中過去扔掉的脂肪組織懸液變為人干細胞庫的重要來源，故而這方面的研究得到了迅速而深入的開展。目前已證實脂肪組織來源干細胞(ATSCs)能向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌肉細胞及心肌細胞定向誘導轉化，可作為多種組織工程的種子細胞，有非常重要的研究和應用價值。

目前人脂肪干細胞的分離和培養中，人脂肪干細胞的生長速度慢，而且細胞分化嚴重，無法滿足臨床研究及日后醫用的需求。

發明內容

針對上述問題，本發明的發明人提出了一種人脂肪干細胞的分離培養方法，并基于該方法提出了干細胞庫的構建方法。

本發明的第一個方面在于公開一種人脂肪干細胞的分離培養方法，所述方法至少包括脂肪干細胞的原代操作步驟，培養方法使用的培養基由DMEM-F12培養基中添加終濃度為1-20％的胎牛血清、1-100ng/ml的bFGF和1-100ng/ml的EGF制成。

優選的，所述DMEM-F12培養基中的胎牛血清添加終濃度為10％、bFGF為10ng/ml、EGF為10ng/ml。

優選的，所述脂肪原代操作步驟包括破碎、清洗、消化、分離、培養步驟。

優選的，所述脂肪原代操作步驟包括：

破碎，將脂肪組織置于離心管中后用剪刀剪碎，用齒鑷剔除肉眼可見的結締組織，然后離心；

清洗，吸出脂肪，用PBS清洗，清洗后離心，取上層的脂肪層；

消化，用Ⅰ型膠原酶37℃搖床消化；用與消化液等量的含10％FBS的低糖DMEM完全培養基終止消化并輕輕吹打；

分離，離心，移除脂肪層及脂肪組織層，吸取下面的細胞，用網篩過濾；

收集濾液于離心管中，離心；

培養，棄去上層脂質層及中間液體層，用所述培養基重懸細胞沉淀后，以1×10⁵～1×10⁷細胞/瓶的密度接種于T75培養瓶中，加入所述培養基，于37.5℃，5％CO₂飽和濕度的培養箱中培養。

優選的，所述脂肪原代操作步驟包括：

破碎，將脂肪組織置于50ml離心管中后用剪刀剪碎，用齒鑷剔除肉眼可見的結締組織，然后1500r/min，離心5min；

清洗，吸出脂肪，用與脂肪組織等量的PBS清洗兩次，清洗后1500rpm/min離心5min，每次清洗完畢后吸取上層的脂肪層；

消化，用與脂肪組織等體積的0.15％Ⅰ型膠原酶37℃搖床消化30min，200r/min；用與消化液等量的含10％FBS的低糖DMEM完全培養基終止消化并輕輕吹打；

分離，1500rpm/min離心5min，移除脂肪層及脂肪組織層，吸取下面的細胞，用200目網篩過濾；收集濾液于50ml離心管中，1500rpm/min離心5min；