[發(fā)明專利]基于唾液蛋白質(zhì)組學(xué)的肝癌肝郁證生物標(biāo)志物檢測的方法

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• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN108287242A
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳正治;丁峰;曹美群;孫珂煥;黃飛娟;范大華;姚永超
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所;吳正治
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 北京華智則銘知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11573
• 代理人: 陳向敏

1.基于唾液蛋白質(zhì)組學(xué)的肝癌肝郁證生物標(biāo)志物檢測的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)樣品蛋白提取：樣本中加入5％的裂解緩沖液進(jìn)行渦旋混勻，超聲60s，振幅22％室溫提取30min；15000r/min、4℃離心20min，取出上清；收集上清，分裝分裝后凍存于-80℃；

(2)蛋白定量：采用Bradford法測定提取的蛋白濃度，先將樣本用裂解緩沖液進(jìn)行一定倍數(shù)稀釋使其終濃度落在標(biāo)曲范圍內(nèi)，稀釋好的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品各取10μl分別和300μl蛋白定量染料避光反應(yīng)20min，用酶標(biāo)儀同時測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣本在595nm下的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品每管吸光值和濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線公式計算各樣品蛋白濃度；

(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于離心管中；加入4μl還原劑，60℃反應(yīng)1h；加入2μl的半胱氨酸阻斷劑，室溫反應(yīng)10min；將還原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超濾管中，12000r/min離心20min，棄掉收集管底部溶液；加入iTRAQ試劑盒中的溶液緩沖液100μl，12000轉(zhuǎn)離心20min，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)3次；更換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量4μg，體積50μl，37℃反應(yīng)過夜；次日，12000r/min離心20min，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；在超濾管中加入50μl溶解緩沖液，12000r/min再次離心20min，與上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的樣品；

(4)iTRAQ標(biāo)記：從冰箱中取出iTRAQ試劑，平衡到室溫，將iTRAQ試劑離心至管底；向每管iTRAQ試劑中加入150μl異丙醇，渦旋振蕩，離心至管底；取50μl酶解后的樣品轉(zhuǎn)移到新的離心管中；將iTRAQ試劑添加到樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應(yīng)2h；加入100μl水終止反應(yīng)；從4組樣品中各取出1ul混合，用Ziptip脫鹽后進(jìn)行MALDI-TOF-TOF鑒定，確認(rèn)標(biāo)記反應(yīng)良好；混合標(biāo)記后的樣品，渦旋振蕩，離心至管底；真空冷凍離心干燥；抽干后的樣品冷凍保存待用；

(5)高pH條件下的反相色譜分離：所需試劑的調(diào)配：流動相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流動相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水調(diào)pH值到10；混合標(biāo)記后的樣品用100ul流動相A溶解，14000r/min離心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA進(jìn)行分離，檢測系統(tǒng)情況；取100ul準(zhǔn)備好的樣本上樣；流速0.7ml/min，得到分離梯度數(shù)據(jù)；

(6)ABI-5600進(jìn)行蛋白質(zhì)分析：所需試劑的調(diào)配：流動相A：100％超純水，0.1％甲酸；流動相B：100％乙腈，0.1％甲酸；將高pH反相分離得到的組份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸復(fù)溶；12000r/min離心10min，吸取上清上樣，上樣體積10μl，采取夾心法上樣；裝載泵流速350nl/min，15min；分離流速350nl/min，得到分離梯度數(shù)據(jù)；

(7)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析：在選擇數(shù)據(jù)庫時，若為已經(jīng)測序生物，直接選用該物種數(shù)據(jù)庫，若為非測序生物，則選擇與被測樣品最為相關(guān)的大類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫；采用ABI-5600型質(zhì)譜儀進(jìn)行iTRAQ的質(zhì)譜分析；

(8)檢測結(jié)果：對肝癌肝郁證和正常對照組進(jìn)行對比實驗，定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示：鑒定1297個蛋白；與正常對照組相比，肝癌肝郁證中鑒定到的1.5倍以上表達(dá)差異的顯著差異蛋白共140個，其中上調(diào)蛋白64個，下調(diào)蛋白76個；差異蛋白列表如下：上調(diào)蛋白如下：

1)檢索號為Q9Y661，基因注釋為Heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 4；

2)檢索號為Q66K66，基因注釋為Transmembrane protein 198；

3)檢索號為P11684，基因注釋為Uteroglobin；

4)檢索號為P0CG06，基因注釋為Ig lambda-3 chain C regions；

5)檢索號為P0CG39，基因注釋為POTE ankyrin domain family member J；

6)檢索號為Q6ZUA9，基因注釋為Maestro heat-like repeat family member 5；

7)檢索號為P31949，基因注釋為Protein S100-A11；

8)檢索號為O60635，基因注釋為Tetraspanin-1；

9)檢索號為P01764，基因注釋為Ig heavy chain V-III region 23；

10)檢索號為P54687，基因注釋為Branched-chain-amino-acid aminotransferase,cytosolic；

11)檢索號為P01743，基因注釋為Ig heavy chain V-I region HG3；

12)檢索號為P04632，基因注釋為Calpain small subunit 1；

13)檢索號為Q9NPC1，基因注釋為Leukotriene B4 receptor 2；

14)檢索號為Q9BPV8，基因注釋為P2Y purinoceptor 13；

15)檢索號為Q8IZF2，基因注釋為Probable G-protein coupled receptor 116；

16)檢索號為P42126，基因注釋為Enoyl-CoA delta isomerase 1,mitochondrial；

17)檢索號為P08637，基因注釋為Low affinity immunoglobulin gamma Fc regionreceptor III-A；

18)檢索號為P83593，基因注釋為Ig kappa chain V-IV region STH(Fragment)；

19)檢索號為P04179，基因注釋為Superoxide dismutase[Mn],mitochondrial；

20)檢索號為P49221，基因注釋為Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase4；

21)檢索號為Q8NDA2，基因注釋為Hemicentin-2；

22)檢索號為Q96JC1，基因注釋為Vam6/Vps39-like protein；

23)檢索號為P41439，基因注釋為Folate receptor gamma；

24)檢索號為P01877，基因注釋為Ig alpha-2 chain C region；

25)檢索號為Q96L46，基因注釋為Calpain small subunit 2；

26)檢索號為P01876，基因注釋為Ig alpha-1 chain C region；

27)檢索號為P05109，基因注釋為Protein S100-A8；

28)檢索號為P06702，基因注釋為Protein S100-A9；

29)檢索號為P46939，基因注釋為Utrophin；

30)檢索號為P01624，基因注釋為Ig kappa chain V-III region POM；

31)檢索號為Q14508，基因注釋為WAP four-disulfide core domain protein 2；

32)檢索號為P04181，基因注釋為Ornithine aminotransferase,mitochondrial；

33)檢索號為O95274，基因注釋為Ly6/PLAUR domain-containing protein 3；

34)檢索號為P01040，基因注釋為Cystatin-A；

35)檢索號為P01834，基因注釋為Ig kappa chain C region；

36)檢索號為P08118，基因注釋為Beta-microseminoprotein；

37)檢索號為P01598，基因注釋為Ig kappa chain V-I region EU；

38)檢索號為Q9UGM3，基因注釋為Deleted in malignant brain tumors 1 protein；

39)檢索號為P22532，基因注釋為Small proline-rich protein 2D；

40)檢索號為P01623，基因注釋為Ig kappa chain V-III region WOL；

41)檢索號為P30048，基因注釋為Thioredoxin-dependent peroxide reductase,mitochondrial；

42)檢索號為P15328，基因注釋為Folate receptor alpha；

43)檢索號為P03973，基因注釋為Antileukoproteinase；

44)檢索號為P01770，基因注釋為Ig heavy chain V-III region NIE；

45)檢索號為P13473，基因注釋為Lysosome-associated membrane glycoprotein 2；

46)檢索號為Q6P995，基因注釋為Protein FAM171B；

47)檢索號為Q6UW32，基因注釋為Insulin growth factor-like family member 1；

48)檢索號為P22528，基因注釋為Cornifin-B；

49)檢索號為P29034，基因注釋為Protein S100-A2；

50)檢索號為P35326，基因注釋為Small proline-rich protein 2A；

51)檢索號為Q5JS37，基因注釋為NHL repeat-containing protein 3；

52)檢索號為Q9NRK6，基因注釋為ATP-binding cassette sub-family B member 10,mitochondrial；

53)檢索號為O95497，基因注釋為Pantetheinase；

54)檢索號為Q9GZN4，基因注釋為Brain-specific serine protease 4；

55)檢索號為P61626，基因注釋為Lysozyme C；

56)檢索號為Q12792，基因注釋為Twinfilin-1；

57)檢索號為Q96HE7，基因注釋為ERO1-like protein alpha；

60)檢索號為P00738，基因注釋為Haptoglobin；

61)檢索號為P59665，基因注釋為Neutrophil defensin 1；

62)檢索號為P80419，基因注釋為Ig heavy chain V-III region GAR；

63)檢索號為O00755，基因注釋為Protein Wnt-7a；

64)檢索號為P36222，基因注釋為Chitinase-3-like protein 1；

65)檢索號為A8K2U0，基因注釋為Alpha-2-macroglobulin-like protein 1；

66)檢索號為P02788，基因注釋為Lactotransferrin；

下調(diào)蛋白如下：

1)檢索號為P15374，基因注釋為Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozymeL3；

2)檢索號為Q15493，基因注釋為Regucalcin；

3)檢索號為O95716，基因注釋為Ras-related protein Rab-3D；

4)檢索號為Q7Z5M8，基因注釋為Abhydrolase domain-containing protein 12B；

5)檢索號為P08571，基因注釋為Monocyte differentiation antigen CD14；

6)檢索號為Q9P0M2，基因注釋為A-kinase anchor protein 7isoform gamma；

7)檢索號為Q9BYB0，基因注釋為SH3 and multiple ankyrin repeat domainsprotein 3；

8)檢索號為P02652，基因注釋為Apolipoprotein A-II；

9)檢索號為P00533，基因注釋為Epidermal growth factor receptor；

10)檢索號為Q9H7L9，基因注釋為Sin3 histone deacetylase corepressor complexcomponent SDS3；

11)檢索號為P58499，基因注釋為Protein FAM3B；

12)檢索號為Q9UHY1，基因注釋為Nuclear receptor-binding protein；

13)檢索號為O60888，基因注釋為Protein CutA；

14)檢索號為P08833，基因注釋為Insulin-like growth factor-binding protein 1；

15)檢索號為Q14289，基因注釋為Protein-tyrosine kinase 2-beta；

16)檢索號為Q9GZZ8，基因注釋為Extracellular glycoprotein lacritin；

17)檢索號為P61956，基因注釋為Small ubiquitin-related modifier 2；

18)檢索號為P35908，基因注釋為Keratin,type II cytoskeletal 2 epidermal；

19)檢索號為Q16378，基因注釋為Proline-rich protein 4；

20)檢索號為P22626，基因注釋為Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1；

21)檢索號為Q9HCU9，基因注釋為Breast cancer metastasis-suppressor 1；

22)檢索號為Q15942，基因注釋為Zyxin；

23)檢索號為O43852，基因注釋為Calumenin；

24)檢索號為P02654，基因注釋為Apolipoprotein C-I；

25)檢索號為P16870，基因注釋為Carboxypeptidase E；

26)檢索號為Q13185，基因注釋為Chromobox protein homolog 3；

27)檢索號為P39687，基因注釋為Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32family member A；

28)檢索號為P23381，基因注釋為Tryptophan--tRNA ligase,cytoplasmic；

29)檢索號為Q86VR7，基因注釋為V-set and immunoglobulin domain-containingprotein 10-like；

30)檢索號為Q9HCF6，基因注釋為Transient receptor potential cation channelsubfamily M member 3；

31)檢索號為Q0VD83，基因注釋為Apolipoprotein B receptor；

32)檢索號為Q9NYL9，基因注釋為Tropomodulin-3；

33)檢索號為Q9GZR7，基因注釋為ATP-dependent RNA helicase DDX24；

34)檢索號為Q15293，基因注釋為Reticulocalbin-1；

35)檢索號為Q8N4F0，基因注釋為BPI fold-containing family B member 2；

36)檢索號為Q8NI35，基因注釋為InaD-like protein；

37)檢索號為Q14118，基因注釋為Dystroglycan；

38)檢索號為P35237，基因注釋為Serpin B6；

39)檢索號為P80303，基因注釋為Nucleobindin-2；

40)檢索號為P30046，基因注釋為D-dopachrome decarboxylase；

41)檢索號為P07711，基因注釋為Cathepsin L1；

42)檢索號為Q9Y490，基因注釋為Talin-1；

43)檢索號為Q02818，基因注釋為Nucleobindin-1；

44)檢索號為P01034，基因注釋為Cystatin-C；

45)檢索號為Q04917，基因注釋為14-3-3protein eta；

46)檢索號為P04264，基因注釋為Keratin,type II cytoskeletal 1；

47)檢索號為Q15121，基因注釋為Astrocytic phosphoprotein PEA-15；

48)檢索號為Q8WVQ1，基因注釋為Soluble calcium-activated nucleotidase 1；

49)檢索號為P27169，基因注釋為Serum paraoxonase/arylesterase 1；

50)檢索號為Q96CX2，基因注釋為BTB/POZ domain-containing protein KCTD12；

51)檢索號為Q9BRZ2，基因注釋為E3 ubiquitin-protein ligase TRIM56；

52)檢索號為Q6BCY4，基因注釋為NADH-cytochrome b5 reductase 2；

53)檢索號為Q9Y4L1，基因注釋為Hypoxia up-regulated protein 1；

54)檢索號為Q9BRK5，基因注釋為45 kDa calcium-binding protein；

55)檢索號為P42768，基因注釋為Wiskott-Aldrich syndrome protein；

56)檢索號為P02808，基因注釋為Statherin；

57)檢索號為P30085，基因注釋為UMP-CMP kinase；

60)檢索號為O15050，基因注釋為TPR and ankyrin repeat-containing protein 1；

61)檢索號為Q8NI51，基因注釋為Transcriptional repressor CTCFL；

62)檢索號為P01036，基因注釋為Cystatin-S；

63)檢索號為P12109，基因注釋為Collagen alpha-1(VI)chain；

64)檢索號為P05154，基因注釋為Plasma serine protease inhibitor；

65)檢索號為Q96FV2，基因注釋為Secernin-2；

66)檢索號為P23280，基因注釋為Carbonic anhydrase 6；

67)檢索號為P63279，基因注釋為SUMO-conjugating enzyme UBC9；

68)檢索號為P13645，基因注釋為Keratin,type I cytoskeletal 10；

69)檢索號為P01037，基因注釋為Cystatin-SN；

70)檢索號為O75792，基因注釋為Ribonuclease H2 subunit A；

71)檢索號為Q9GZM5，基因注釋為Protein YIPF3；

72)檢索號為P15515，基因注釋為Histatin-1；

73)檢索號為P02814，基因注釋為Submaxillary gland androgen-regulated protein3B；

74)檢索號為Q96P44，基因注釋為Collagen alpha-1(XXI)chain；

75)檢索號為Q8TF64，基因注釋為PDZ domain-containing protein GIPC3；

76)檢索號為Q9Y4Y9，基因注釋為U6snRNA-associated Sm-like protein LSm5；

77)檢索號為Q13217，基因注釋為DnaJ homolog subfamily C member 3；

78)檢索號為Q99574，基因注釋為Neuroserpin。