[發(fā)明專利]一種MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系及其構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711236916.7
• 申請(qǐng)日: 2017-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN108085298A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴仁科;王珍玉;戴天明;江偉凡;郭佳音;鄧?yán)^峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山琺瑪斯醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/113
• 代理公司: 北京眾合誠成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

本發(fā)明公開了一種MDCK?MDR1的藥物吸收篩選體系及其構(gòu)建方法，針對(duì)MDCK細(xì)胞中犬P?gp基因設(shè)計(jì)出了sgRNA，將設(shè)計(jì)的sgRNA序列合成Oligo，構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體；將人源MDR1基因轉(zhuǎn)染至MDCK?KO細(xì)胞中，篩選擴(kuò)大陽性單克隆；蛋白免疫印跡法檢測(cè)p?gp蛋白表達(dá)，成功表達(dá)者即表示MDCK?MDR1的藥物吸收篩選體系構(gòu)建成功。本發(fā)明基于工程技術(shù)敲除MDCK細(xì)胞中犬P?gp蛋白的基因，以背景完全“干凈”的MDCK細(xì)胞作為宿主細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源p?gp蛋白的MDCK?MDR1細(xì)胞系，從而完善MDCK?MDR1作為血腦屏障藥吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)篩選模型的功能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種基因敲除MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)運(yùn)體所介導(dǎo)的外源性化合物及其代謝產(chǎn)物的外排是一種非常重要的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，在各種屏障及排泄組織的功能中起到關(guān)鍵的作用。例如腸粘膜、血腦屏障、血睪丸屏障以及腎近端小管和肝臟。幾種ATP依賴的(ATP-Binding Cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族包括：多藥耐藥蛋白(MDR1/P-glycoprotein)、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)及幾種多藥耐藥聯(lián)合蛋白家族(MRP)在這些屏障組織中都有高表達(dá)，它們?cè)谒幬矬w內(nèi)分布中的重要作用不容爭(zhēng)議。

單層膜上皮細(xì)胞模型經(jīng)常被用于研究ABC外排轉(zhuǎn)運(yùn)體在藥物分布中的作用，其中一個(gè)常用的細(xì)胞系是MDCK。

MDCK細(xì)胞系為馬丁達(dá)比犬腎上皮細(xì)胞發(fā)展的一種細(xì)胞間連接非常緊密的細(xì)胞系，低水平表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，低代謝活性。MDCK細(xì)胞是在遺傳學(xué)方面及細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)組成方面最為理想的上皮細(xì)胞系。可用于腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能的研究，同時(shí)其許多生理特性均與血腦屏障(bloodbrainbarrier,BBB)相似，常用于體外藥物透過BBB的篩選模型。在研究主動(dòng)吸收藥物的滲透性方面，Caco-2和MDCK之間有很好的相關(guān)性，因此用MDCK細(xì)胞代替Caco-2細(xì)胞作為腸道模型。早在1988年，Pastan等用人類的mdr1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞建立了一個(gè)能大量表達(dá)P-gp的細(xì)胞系。MDCK-MDR1細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)就是培養(yǎng)周期短，可達(dá)到代與代間的均一性，獲得人P-gp的高表達(dá)。細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的P-gp主要是位于細(xì)胞膜的頂側(cè)。因此，可利用MDCK-MDR1細(xì)胞作為腸道黏膜和BBB藥物透過的快速篩選模型。

然而，利用MDCK-MDR1細(xì)胞作為BBB的模型時(shí)也存在一些不足，MDCK分泌較少的犬P-gp，也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的可靠性。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系及其構(gòu)建方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)、針對(duì)MDCK細(xì)胞中犬P-gp基因設(shè)計(jì)出了sgRNA，用于靶點(diǎn)基因敲除；

(2)、以U6啟動(dòng)子表達(dá)sgRNA，將設(shè)計(jì)的sgRNA序列合成Oligo，構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體；

(3)、在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK-WT細(xì)胞中，加入sgRNA表達(dá)載體和GenJet形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，37℃反應(yīng)20min，加入新鮮培養(yǎng)基，48h后以1：3比例傳孔，第二天加800ug/ml的G418進(jìn)行篩選，大量細(xì)胞死亡，停止加藥，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后鋪單克隆，每3天換藥一次，待細(xì)胞大量死亡，降低G418篩選濃度至200μg/ml或撤除G418，15天左右待細(xì)胞單克隆長(zhǎng)至0.5cm左右進(jìn)行挑取篩選陽性單克隆；