[發(fā)明專利]一種MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系及其構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711236916.7
• 申請(qǐng)日: 2017-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108085298A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴仁科;王珍玉;戴天明;江偉凡;郭佳音;鄧?yán)^峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山琺瑪斯醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/113
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、針對(duì)MDCK細(xì)胞中犬P-gp基因設(shè)計(jì)出了sgRNA，用于靶點(diǎn)基因敲除；

(2)、以U6啟動(dòng)子表達(dá)sgRNA，將設(shè)計(jì)的sgRNA序列合成Oligo，構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體；

(3)、在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型MDCK細(xì)胞中，加入sgRNA表達(dá)載體和GenJet形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，37℃反應(yīng)20min，加入新鮮培養(yǎng)基，48h后以1：3比例傳孔，第二天加800ug/ml的G418進(jìn)行篩選，大量細(xì)胞死亡，停止加藥，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后鋪單克隆，每3天換藥一次，待細(xì)胞大量死亡，降低G418篩選濃度至200μg/ml或撤除G418，15天左右待細(xì)胞單克隆長(zhǎng)至0.5cm左右進(jìn)行挑取篩選陽(yáng)性單克隆；

(4)、取陽(yáng)性單克隆菌株，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml，加入到6孔板中，每孔2ml，24h后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，2μg人源MDR1質(zhì)粒+5ul脂質(zhì)體+700ul優(yōu)化液加到MDCK-KO細(xì)胞表面，6h后棄去轉(zhuǎn)染液，加入新鮮培養(yǎng)基孵育48h；加入含G418(800ug/ml)進(jìn)行篩選，8-10天后，絕大部分細(xì)胞死亡，將存活的細(xì)胞消化后接種到96孔板中進(jìn)行單克隆篩選，待單克隆形成后擴(kuò)大培養(yǎng)；

(5)、蛋白免疫印跡法檢測(cè)p-gp蛋白表達(dá)，成功表達(dá)者即表示MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系構(gòu)建成功。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)包括以下步驟：

A、將sgRNA靶點(diǎn)插入粘末端之中，合成Oligo，Oligo退火，得到質(zhì)粒DNA；

B、將所述質(zhì)粒DNA線性化；

C、連接及鑒定重組質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述退火的反應(yīng)體系為：正義鏈10ul、反義鏈10μl、NEB buffer 5ul、H2O 25μl、Total 50μl。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述退火的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃加熱10min，自然冷卻至室溫。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述質(zhì)粒DNA線性化的反應(yīng)體系為：質(zhì)粒DNA5μl、BbsI 1μl、Buffer 3μl、H2O 21μl、Total 30μl；所述質(zhì)粒線性化的反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃反應(yīng)2hr，切膠回收線性化片段，即得。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述連接反應(yīng)的反應(yīng)體系為：線性化質(zhì)粒DNA 1μl、退火Oligo反應(yīng)液4μl、Solution I 5μl、Total 10μl。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述鑒定重組質(zhì)粒是采用菌落PCR進(jìn)行的，反應(yīng)體系為：EX Taq Mix 10uL、Sp6引物0.8uL、正義鏈引物0.8uL、菌液1uL、H2O 7.4uL、Total 20uL。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min→95℃30s，58℃30s，60℃30s，30cycles→72℃5min→16℃∞。

9.權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系。