[發明專利]一種MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系及其構建方法

在審

• 申請號: 201711236916.7
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN108085298A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發明（設計）人: 戴仁科;王珍玉;戴天明;江偉凡;郭佳音;鄧繼峰
• 申請（專利權）人: 中山琺瑪斯醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、針對MDCK細胞中犬P-gp基因設計出了sgRNA，用于靶點基因敲除；

(2)、以U6啟動子表達sgRNA，將設計的sgRNA序列合成Oligo，構建sgRNA表達載體；

(3)、在對數生長期的野生型MDCK細胞中，加入sgRNA表達載體和GenJet形成的轉染復合物，37℃反應20min，加入新鮮培養基，48h后以1：3比例傳孔，第二天加800ug/ml的G418進行篩選，大量細胞死亡，停止加藥，待細胞進入對數生長期后鋪單克隆，每3天換藥一次，待細胞大量死亡，降低G418篩選濃度至200μg/ml或撤除G418，15天左右待細胞單克隆長至0.5cm左右進行挑取篩選陽性單克隆；

(4)、取陽性單克隆菌株，生長至對數生長期后，調整細胞濃度至1×105個/ml，加入到6孔板中，每孔2ml，24h后進行質粒轉染，2μg人源MDR1質粒+5ul脂質體+700ul優化液加到MDCK-KO細胞表面，6h后棄去轉染液，加入新鮮培養基孵育48h；加入含G418(800ug/ml)進行篩選，8-10天后，絕大部分細胞死亡，將存活的細胞消化后接種到96孔板中進行單克隆篩選，待單克隆形成后擴大培養；

(5)、蛋白免疫印跡法檢測p-gp蛋白表達，成功表達者即表示MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系構建成功。

2.根據權利要求1所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)包括以下步驟：

A、將sgRNA靶點插入粘末端之中，合成Oligo，Oligo退火，得到質粒DNA；

B、將所述質粒DNA線性化；

C、連接及鑒定重組質粒。

3.根據權利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構建方法，其特征在于，所述退火的反應體系為：正義鏈10ul、反義鏈10μl、NEB buffer 5ul、H2O 25μl、Total 50μl。

4.根據權利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構建方法，其特征在于，所述退火的反應程序為：98℃加熱10min，自然冷卻至室溫。

5.根據權利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構建方法，其特征在于，所述質粒DNA線性化的反應體系為：質粒DNA5μl、BbsI 1μl、Buffer 3μl、H2O 21μl、Total 30μl；所述質粒線性化的反應程序為：37℃反應2hr，切膠回收線性化片段，即得。

6.根據權利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構建方法，其特征在于，所述連接反應的反應體系為：線性化質粒DNA 1μl、退火Oligo反應液4μl、Solution I 5μl、Total 10μl。

7.根據權利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構建方法，其特征在于，所述鑒定重組質粒是采用菌落PCR進行的，反應體系為：EX Taq Mix 10uL、Sp6引物0.8uL、正義鏈引物0.8uL、菌液1uL、H2O 7.4uL、Total 20uL。

8.根據權利要求2所述的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系的構建方法，其特征在于，所述反應程序為95℃5min→95℃30s，58℃30s，60℃30s，30cycles→72℃5min→16℃∞。

9.權利要求1～8任一項所述的構建方法構建得到的MDCK-MDR1的藥物吸收篩選體系。