[發明專利]一種交聯肽段富集方法及其在蛋白質相互作用研究中的應用

有效

• 申請號: 201711226826.X
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN109839303B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 張麗華;方菲;趙群;安雨馨;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/40
• 分類號: G01N1/40;G01N27/62
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種用于交聯肽段富集的方法，其特征在于：使用連接臂上含有鄰二羥基基團的交聯劑對細胞或提取的蛋白質樣品進行交聯，將交聯蛋白質樣品進行酶解后，采用硼親和材料選擇性富集交聯肽段，從而獲取蛋白質結構及蛋白質相互作用信息；

具體包括：

（1）對于細胞樣品，使用緩沖液沖洗去除培養液并使細胞懸浮；對于已提取出的蛋白樣品，使用水或緩沖液配制成溶液；對于交聯劑，使用水、緩沖液或有機溶劑配制成溶液；

（2）將交聯劑溶液加入至細胞樣品溶液或蛋白樣品溶液中進行反應；

（3）對于細胞樣品，離心棄去反應體系中的反應液，然后對細胞樣品進行裂解，得交聯蛋白樣品；對于蛋白樣品，向反應體系中加入反應終止液，或通過透析、濾膜或凝膠去除反應液，得交聯蛋白樣品；

（4）采用pH為1-6.5的酸性緩沖溶液或pH為7.5-14的堿性緩沖溶液配制的溶有表面活性劑或有機溶劑的溶解液來溶解交聯蛋白樣品，加入還原劑，高溫孵育，同時進行蛋白質樣品的變性及還原；

（5）加入烷基化試劑對變性及還原后的蛋白質樣品進行烷基化反應后，向蛋白質樣品中加入蛋白酶溶液進行酶解，并將酶解產物進行除鹽并凍干；

（6）向步驟（5）的產物中加入帶有硼親和基團的富集材料；

（7）使用洗脫液洗去富集材料上非特異性吸附的肽段；

（8）使用酸性溶液將富集材料上鍵合的肽段釋放出來，除鹽，凍干并重溶，進行質譜分析和數據檢索；

步驟（1）中所述的交聯劑濃度為1 μM-1 M；

所述的交聯劑為兩側具有與蛋白上氨基反應的活性基團的化學物，活性基團為琥珀酰亞胺基團、鹵代芳烴基團、亞胺酸酯基團中的一種或二種；或為兩側具有與蛋白上巰基反應的活性基團的化學物，活性基團為馬來酰亞胺基團、2-巰基吡啶基團、硫代磺酸基團、鹵代乙酰基團中的一種或二種；或為兩側具有與蛋白上羧基反應的活性基團的化學物，活性基團為碳二亞胺基團、異氰酸基團中的一種或二種；或為兩側具有與蛋白上糖鏈反應的活性基團的化學物，活性基團為酰肼基團、氨基基團中的一種或二種；或為兩側具有與蛋白上任意基團反應的活性基團的化學物，活性基團為苯基疊氮基團、雙吖丙啶基團中的一種或二種；所述的交聯劑，其兩側活性反應基團分別為上述任一反應基團；所述的交聯劑，其連接臂上的化學富集基團，為鄰二羥基基團；

步驟（3）中所述的反應終止液為具有能與交聯劑兩側反應基團反應的基團的物質；

步驟（6）中所述的硼親和基團的單體為2-羧基苯硼酸、5-羧基-2-羥甲基苯硼酸、4-甲酰基苯硼酸、氨基苯硼酸或5-氨基-2-羥甲基苯硼酸中的一種或二種以上；

所述富集材料的基質為瓊脂糖凝膠球、硅球或聚合物球有機/無機材料；

步驟（7）中所述的洗脫液為下述中的一種：濃度為0.1-8 M的氯化鈉溶液、0.1-8 M的氯化鉀溶液、0.1-1 M的碳酸鈉溶液、2-10 M的尿素溶液、1-8 M的鹽酸胍溶液或10-1000 mM的碳酸氫銨溶液；乙腈、甲醇、異丙醇；十二烷基磺酸鈉、Triton X-100、Chaps、Tween；

步驟（8）中所述的交聯肽段釋放溶液為pH為1-6.5的酸性溶液，酸性溶液為甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液中的一種或二種以上。

2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的緩沖液為pH為7.1-10的碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖鹽溶液或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液中的一種或二種以上，且不含能與所用交聯劑上反應基團反應的基團；

步驟（1）中所述的細胞樣品，為胰酶消化或細胞刮消化得到的活細胞樣品；步驟（1）中所述的蛋白樣品，為單一蛋白樣品或二種以上蛋白的混合蛋白樣品，配制的蛋白質量與溶液的體積比為1 μg/mL-100 mg/mL；步驟（1）中所述的有機溶劑，為乙腈、有機醇類、有機酸類、二甲基甲酰胺(DMF）或二甲基亞砜 (DMSO) 中的一種或二種以上。

3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）中所述的反應體系中細胞濃度為10⁶-10⁹個/mL，蛋白終濃度為1 nM-1 mM，交聯劑的終濃度為10 nM-100 mM；所述的反應條件為15-40℃反應10 min-2 h或0-10℃反應10 min-10 h。