[發(fā)明專利]一種交聯(lián)肽段富集方法及其在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN109839303B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張麗華;方菲;趙群;安雨馨;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: G01N1/40
• 分類號: G01N1/40;G01N27/62
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發(fā)明涉及一種交聯(lián)肽段富集方法及其在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用。使用兩側(cè)具有反應(yīng)活性基團(tuán)且連接臂上含有鄰二羥基基團(tuán)的交聯(lián)劑將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行交聯(lián)并酶解，隨后采用硼親和材料對交聯(lián)肽段進(jìn)行選擇性富集和高效釋放。該方法具有操作簡便、高效、高通量、高可信度的優(yōu)點(diǎn)并應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種交聯(lián)肽段富集方法及其在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是近十多年來發(fā)展起來的新技術(shù)，它利用化學(xué)交聯(lián)劑將細(xì)胞內(nèi)空間距離足夠接近、可以與交聯(lián)劑反應(yīng)的兩個氨基酸以共價鍵連接起來，然后利用基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)對交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間相互作用方式的解析(Sinz,A.,Expert Rev.Proteomics.,2014,11(6):733-743.)。

然而，使用傳統(tǒng)交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對質(zhì)譜鑒定要求很高。由于每個位點(diǎn)的實(shí)際交聯(lián)效率往往遠(yuǎn)低于100％，所以交聯(lián)肽段豐度偏低，交聯(lián)譜圖數(shù)目少、信號差，給交聯(lián)譜圖鑒定帶來困難。此外，對于復(fù)雜蛋白質(zhì)復(fù)合體樣品，進(jìn)入質(zhì)譜分析之前，需要對其進(jìn)行酶切。交聯(lián)蛋白質(zhì)在不同位置發(fā)生酶切會生成三種產(chǎn)物：a.被交聯(lián)劑修飾的單肽，即交聯(lián)劑一端發(fā)生水解，僅一端與肽段進(jìn)行反應(yīng)(Type-0型肽段)；b.肽段內(nèi)部交聯(lián)，即交聯(lián)劑兩端結(jié)合位點(diǎn)在同一條肽段上(Type-1型交聯(lián)肽段)；c.肽段間交聯(lián)，即交聯(lián)劑兩端結(jié)合位點(diǎn)分別在兩條肽段上(Type-2型交聯(lián)肽段)。由于交聯(lián)試劑兩側(cè)的反應(yīng)基團(tuán)水解速率快，Type-0型肽段含量遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)相互作用解析所需的Type-1型和Type-2型交聯(lián)肽段。

為提高交聯(lián)肽段的豐度，目前已發(fā)展出含有不同類型富集基團(tuán)(如炔基-疊氮、生物素-親和素等)的交聯(lián)試劑，然而，由于三種產(chǎn)物中均含有交聯(lián)劑，因此使用含常規(guī)富集基團(tuán)的交聯(lián)試劑無法將交聯(lián)肽段與Type-0型肽段進(jìn)行分離。此外，由于加入特定基團(tuán)的緣故，一般臂長要比簡單的交聯(lián)劑更長，這使得交聯(lián)效率有所下降，得到的交聯(lián)位點(diǎn)之間的距離限制作用也會變?nèi)酢Ｍ瑫r，大分子量基團(tuán)的引入會導(dǎo)致交聯(lián)肽段在質(zhì)譜中更加難以碎裂。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服常規(guī)化學(xué)交聯(lián)方法無法實(shí)現(xiàn)對交聯(lián)肽段選擇性富集，且會在交聯(lián)肽段上引入修飾基團(tuán)等不足，本發(fā)明提供一種使用連接臂上含有鄰二羥基基團(tuán)的交聯(lián)劑將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行交聯(lián)并酶解，隨后采用硼親和材料選擇性富集交聯(lián)肽段并高效釋放。該方法具有操作簡便、高效、高通量、高可信度的優(yōu)點(diǎn)并應(yīng)用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析及蛋白質(zhì)復(fù)合體相互作用結(jié)合位點(diǎn)的分析。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

(1)蛋白質(zhì)/細(xì)胞樣品溶液及交聯(lián)劑溶液的配制：對于胰酶消化或細(xì)胞刮消化得到的活細(xì)胞樣品，使用pH為7.1-10的碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖鹽溶液或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液中的一種或二種以上，且不含與所用交聯(lián)劑上反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)的緩沖液沖洗去除培養(yǎng)液并使細(xì)胞懸浮；對于單一蛋白樣品或混合蛋白樣品，使用水或緩沖液配制成濃度為1μg/mL-100mg/mL的蛋白溶液；使用水、緩沖液或乙腈、有機(jī)醇類、有機(jī)酸類、DMF或DMSO中的一種或二種以上的有機(jī)溶劑配制成濃度為1μM-1M的交聯(lián)劑溶液，使用的交聯(lián)劑兩側(cè)含有琥珀酰亞胺、鹵代芳烴、亞胺酸酯、馬來酰亞胺、2-巰基吡啶、硫代磺酸鹽、鹵代乙酰基、碳二亞胺、異氰酸鹽、酰肼、苯基疊氮、雙吖丙啶等上述一種或兩種反應(yīng)基團(tuán)，且連接臂上含有鄰二羥基基團(tuán)；

(2)交聯(lián)反應(yīng)：將交聯(lián)劑溶液加入至細(xì)胞樣品或蛋白樣品中進(jìn)行反應(yīng)，對于細(xì)胞樣品，反應(yīng)體系中細(xì)胞濃度為10⁶-10⁹個/mL，對于蛋白樣品，反應(yīng)體系中蛋白濃度為1nM-1mM，交聯(lián)劑的濃度為10nM-100mM；所述的反應(yīng)條件為15-40℃反應(yīng)10min-2h或0-10℃反應(yīng)10min-10h；