[發明專利]攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201711226242.2
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107937438B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 陳舜;王濤;程安春;汪銘書
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

本發明涉及一種攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子及其構建方法和應用，所述復制子是在坦布蘇病毒刪除編碼結構基因后在編碼C蛋白N端前38個氨基酸的序列之后連入海腎熒光素酶報告基因，并在Rluc后插入編碼口蹄疫病毒自剪接肽的序列FMDV2A，在坦布蘇病毒的復制子5’UTR序列上游添加真核啟動子CMV及原核啟動子T7，在3’UTR下游添加丁型肝炎病毒核酶序列HDVr及SV40poly(A)序列，獲得的復制子能夠精確定量反映復制子在細胞內的復制情況，可方便的應用于研究坦布蘇病毒乃至其他黃病毒的復制機理、抗病毒藥物篩選、病毒與蛋白互作等。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子，還涉及瞬時轉染復制子的構建方法和應用。

背景技術

我國是世界養禽大國，更是世界最大的養鴨國。鴨坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)是一種能引起產蛋鴨采食量和產蛋率急劇下降，甚至停產直至死亡的一種新型黃病毒。鴨坦布蘇病毒病自2010年首次爆發以來，給我國的養鴨產業造成了巨大的經濟損失。幾乎所有品種的鴨都能感染鴨坦布蘇病毒，包括櫻桃谷鴨、北京鴨、麻鴨等，其主要臨床癥狀為：體溫升高、食欲顯著下降，四肢無力、癱瘓；產蛋大幅下降，排草綠色稀便，氣味惡臭；雛鴨感染后以癱瘓、頭頸震顫為特征。種鴨感染后，其特征性病變為卵泡膜出血，卵泡變形甚至破裂，所以該病曾被稱為“出血性卵巢炎”，蛋鴨產蛋量大幅度下降甚至停止產蛋，嚴重者能夠導致死亡，死亡率可以達到10％-30％。剖檢時可以見到脾臟明顯腫大，另外部分鴨肝臟出血嚴重，并同時伴有針尖狀白色壞死點；卵巢病理變化非常嚴重，出血、萎縮、破裂，輸卵管有大量粘液。此外，有報道雞、鵝、麻雀等也能感染該病。

鴨坦布蘇病毒是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組約11kb，有I型帽子結構，無poly(A)尾巴，編碼一條3425個氨基酸的多聚肽鏈。病毒基因組5’端和3’端分別有90～100bp、550～600bp非編碼區，對病毒的復制起到重要作用。病毒基因組編碼的多聚肽鏈在宿主細胞內酶和自身編碼的非結構蛋白的作用下，裂解為10個單體蛋白，分別是衣殼蛋白C，膜蛋白前體蛋白prM，囊膜蛋白E，以及7個非結構蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。

黃病毒復制子包含所有與病毒自我復制相關的元件，能夠在宿主細胞體內自我復制，但不能編碼結構蛋白，因此不會產生具有感染性的病毒粒子。基于DNA的復制子能夠對黃病毒除刪除掉的編碼結構基因以外的任意位點進行突變，對于研究病毒的復制，非結構蛋白細胞內定位以及病毒包裝有重要意義。復制子已經在其他黃病毒上得到了極大的應用，如黃熱病毒(YFV)、登革病毒(DEGV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、昆病毒(KUN)、西尼羅病毒(WNV)，目前國內外尚無構建成功坦布蘇病毒復制子的相關報道。因此，構建坦布蘇病毒復制子對于研究坦布蘇病毒甚至黃病毒其他病毒的復制、病毒的包裝、抗病毒藥物的篩選均有重大的意義及幫助，有助于理解坦布蘇病毒的復制機理，更深入研究坦布蘇病毒。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子，通過在黃病毒的復制子的基礎上，人為插入一個能夠編碼熒光素酶的基因，使病毒非結構蛋白的表達情況能夠通過檢測熒光素酶活性或者檢測熒光蛋白表達量來判斷；通過構建的復制子質粒，可以實現在分子水平對黃病毒的改造，對于研究坦布蘇病毒甚至黃病毒其他病毒的復制、病毒的包裝、抗病毒藥物的篩選均有重大的意義及幫助，有助于理解坦布蘇病毒的復制機理，更深入研究坦布蘇病毒。通過檢測報告基因的活性能夠方便且準確的定量檢測TMUV復制子的復制情況。本發明的目的之二在于提供攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子的制備方法；本發明的目的之三在于提供攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子在定量檢測鴨坦布蘇病毒復制子的復制情況中的應用；本發明的目的之四在于提供攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子在研究黃病毒的復制機理或抗病毒藥物篩選中的應用。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：