[發明專利]攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201711226242.2
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107937438B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 陳舜;王濤;程安春;汪銘書
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

1.攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子，其特征在于：所述復制子是在坦布蘇病毒刪除編碼結構基因后編碼C蛋白N端前38個氨基酸的序列之后連入海腎熒光素酶報告基因，并在海腎熒光素酶報告基因后插入編碼口蹄疫病毒自剪接肽的序列FMDV 2A，坦布蘇病毒的復制子5’UTR序列上游添加真核啟動子CMV及原核啟動子T7，在3’UTR下游添加丁型肝炎病毒核酶序列HDVr及SV40 poly(A)序列，所述復制子的核苷酸序列如SEQ IDNo.23所示。

2.權利要求1所述攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）以pEGFP-C2質粒為模板，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4作引物，PCR擴增得到CMV；再以pEGFP-C2質粒為模板SEQ ID No.5和SEQ ID No.6作引物，PCR擴增得到SV40，將擴增產物回收并純化；然后將CMV通過Nhe I和Spe I酶切位點與pACYC 177A質粒連接，獲得pACYC177A-CMV質粒，接著將SV40通過NotI和ClaI酶切位點與pACYC 177A-CMV質粒連接，獲得pACYC177B質粒；

2）以pACYC FL-TMUV質粒為模板，SEQ ID No.8和SEQ ID No.9作引物，擴增得到C38；不添加模板，將SEQ ID No.10和SEQ ID No.11直接PCR得到FMDV 2A；以pACYC FL-TMUV質粒為模板，SEQ ID No.13和SEQ ID No.14作引物，擴增得到E30-XhoI；以pRL-TK質粒作模板，SEQID No.20和SEQ ID No.21作引物，擴增得到Rluc；再以擴增獲得的C38和Rluc為模板，SEQID No.8和SEQ ID No.21作引物，熔合PCR得到SpeI-Rluc，以FMDV 2A、E30-XhoI為模板，SEQNo.12和SEQ No.14作引物，熔合PCR得到FMDV 2A-XhoI；接著以SpeI-Rluc，FMDV 2A-XhoI為模板，SEQ ID No.8和SEQ ID No.14作引物，熔合PCR擴增得到SpeI-XhoI；最后以SpeI-XhoI為模板，SEQ ID No.15和SEQ ID No.22作引物，擴增得到P1-Rluc；將擴增產物回收并純化；

3）以pACYC FL-TMUV質粒為模板，SEQ ID No.16和SEQ ID No.17作引物，PCR擴增得到P2；以pACYC FL-TMUV質粒為模板，SEQ ID No.18和SEQ ID No.19作引物，PCR擴增得到P3，將擴增產物回收并純化；

4）將步驟3）擴增獲得的P3與步驟1）構建的pACYC177B質粒通過EcoRV和NotI連接，得到pACYC-Rep-TMUV-P3質粒；再將P2通過XhoI和EcoRV連接到pACYC-Rep-TMUV-P3載體上，得到pACYC-Rep-TMUV-P_2-3質粒，最后將步驟2）獲得的P1-Rluc通過SpeⅠ 和XhoⅠ 連接到pACYC-Rep-TMUV-P_2-3上，得到pACYC-Rep-TMUV-Rluc質粒，即獲得攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子。

3.根據權利要求2所述攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子的制備方法，其特征在于：步驟1）至步驟3）中，PCR擴增程序為98℃預變性2min；98℃變性10s；55℃退火 15s，72℃延伸10s ；共30個循環；最后72℃延伸5min。

4.根據權利要求2所述攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子的制備方法，其特征在于：步驟1）至步驟3）中，熔合PCR反應程序：98℃預變性2min；98℃變性10s；55℃退火 15s，72℃延伸10s；共30個循環；最后72℃延伸5min。

5.權利要求1所述攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子在定量檢測鴨坦布蘇病毒復制子的復制情況中的應用。

6.權利要求1所述攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時轉染復制子在研究黃病毒的復制機理或抗病毒藥物篩選中的應用。