[發(fā)明專利]一種寨卡病毒的重組基因及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711222741.4
• 申請(qǐng)日: 2017-11-29
• 公開（公告）號(hào): CN107988239B
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李紅衛(wèi);劉軍;顧為望;李青青;仇珍珍;利曉欣;萬鵬飛;陳晃耀;梁文翰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/40
• 分類號(hào): C12N15/40;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務(wù)所(普通合伙) 44244
• 代理人: 胡濟(jì)元

本發(fā)明涉及一種寨卡病毒的重組基因，該重組基因的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。將所述的重組基因插入到商用載體pMD19?T中得到表達(dá)載體，再將病毒穿梭載體VSV?G克隆所述的表達(dá)載體中得到克隆載體，然后所得到的克隆載體與含綠色熒光蛋白報(bào)告基因的慢病毒包裝核心載體pLV?eGFP和慢病毒輔助質(zhì)粒psPAX2共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK?293T即得到重組假病毒。由于所述的重組假病毒不僅可以替代天然寨卡病毒進(jìn)行血清中和抗體滴度的評(píng)價(jià)，而且可用于制備腦或腎臟的靶向載體。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)，具體涉及寨卡病毒的Env基因DNA變構(gòu)重組，該重組基因可用于制備腎臟靶向載體。

背景技術(shù)

Zika病毒(ZIKV)是經(jīng)蚊蟲等媒介傳播的黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)病毒。與登革熱類似，ZIKV感染可導(dǎo)致輕度或急性發(fā)熱性疾病，頭痛和肌痛。2007年亞太島爆發(fā)后，東南亞，撒哈拉以南非洲地區(qū)以及南美洲和中美洲地區(qū)出現(xiàn)零星病例。2016年2月，中國衛(wèi)生部通報(bào)了首例輸入性ZIKV感染患者。孕婦感染寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)后，病毒穿過胎盤，在胚胎發(fā)育過程中特異性侵入皮層神經(jīng)前期細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，引發(fā)嬰兒小頭癥和先天性畸形。ZIKV感染也與成年人的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如吉蘭-巴雷綜合征，患者失去勞動(dòng)能力，給家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重危害。2016年1月WHO宣布ZIKV的爆發(fā)和傳播已經(jīng)成為全球緊急公共衛(wèi)生事件。

由于傳染性高，難以獲得病原體，從而阻礙了對(duì)ZIKV的生物學(xué)研究，包括抗病毒藥物研究和疫苗開發(fā)。假型病毒作為替代方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原體的生物學(xué)特征研究，特別是對(duì)于難以在體外培養(yǎng)或需要較高生物安全等級(jí)設(shè)施的病毒。自1996年首次報(bào)道慢病毒載體系統(tǒng)以來，基于慢病毒的假型病毒已廣泛用于許多鑒定病毒入胞的研究，中和抗體測(cè)定，篩選新型宿主細(xì)胞受體和抗病毒藥物，以及疫苗的開發(fā)。ZIKV基因組由編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C，prM/M，E)和七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)的單股正鏈RNA組成，文獻(xiàn)報(bào)道表明,包膜病毒的表面蛋白在靶細(xì)胞的感染中起重要作用，因?yàn)樗閷?dǎo)病毒體與細(xì)胞受體的連接。

外源基因進(jìn)入機(jī)體實(shí)質(zhì)器官的細(xì)胞中是基因治療的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，在基礎(chǔ)研究和臨床治療中，尋找腎臟靶向性病毒載體一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種寨卡病毒的重組基因，該重組基因所制備的重組假病毒可用于制備腦或腎臟的靶向載體。

本發(fā)明解決技術(shù)問題的方案如下：

一種寨卡病毒(ZIKV)的重組基因，該重組基因的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。

上述重組基因可按SEQ ID NO 1所示序列采用基因合成儀人工合成。

上述重組基因翻譯后的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體是插入有SEQ ID NO 1所示重組基因的pMD19-T載體。

一種重組假病毒制備方法，該方法由以下步驟組成：

(1)將上述表達(dá)載體和慢病毒穿梭載體VSV-G分別進(jìn)行Xho I單酶切以及瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收小片段和大片段；然后，對(duì)VSV-G酶切回收的大片段進(jìn)行補(bǔ)平及去磷，對(duì)上述表達(dá)載體酶切回收的小片段進(jìn)行補(bǔ)平，再將所得到的兩個(gè)片段采用NEB的T4連接酶連接，得到克隆載體pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC；

(2)將所得到的克隆載體pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC與含綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因的慢病毒包裝核心載體pLV-eGFP和慢病毒輔助質(zhì)粒psPAX2共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK-293T；共轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集培養(yǎng)上清，離心去細(xì)胞碎片，即得所述的重組假病毒；其中，