[發明專利]基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡、制備及檢測方法

在審

• 申請號: 201711220767.5
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107748252A
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 李秀梅;陳小云;任雪建;張志鵬;王俊峰;張小輝;王藍天
• 申請（專利權）人: 洛陽萊普生信息科技有限公司;洛陽現代生物技術研究院有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙)41120
• 代理人: 張隨

技術領域

本發明屬于免疫學檢測領域，具體地，涉及基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙條、制備及檢測方法。

背景技術

山羊傳染性胸膜肺炎（Mccp）又稱為山羊支原體肺炎，引起山羊支原體肺炎的病原體是山羊絲狀支原體，屬于羊絲狀支原體山羊亞種，是山羊特有的急性或慢性高度接觸性傳染病。本病以高熱、咳嗽、肺臟及胸膜發生漿液性和纖維素性炎癥為臨床特征，病死率高。近年來，我國相繼在甘肅、山東、青海等地分離或檢測到Mccp的病原體，其發病率和死亡率呈上升趨勢，給我國山羊養殖業造成了較大的經濟損失。

快速準確的診斷有利于Mccp的預防與控制，目前國內外已報道的用于Mccp抗體檢測的方法有很多，主要技術有間接血細胞凝集試驗，直接和間接熒光抗體測試，補體結合試驗，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）以及OIE推薦的PCR技術，但多有諸如操作復雜、重復性或特異性差、需實驗室儀器等缺點，尤其不適合我國動物疾病診斷實際中快速、易于操作和適于基層使用的要求。在獸疫臨床疾病診斷和檢驗檢疫中，通常應用于養殖場和廣大基層單位，面對大批量樣本、大面積普查和現場診斷的需求，免疫膠體金技術是現在市場上應用最廣泛的，其具有檢測快捷、方便、無需特殊儀器等優勢，但也存在不足：膠體金標記方式是靜電吸附，穩定性差；膠體金技術結果判定以肉眼識別，誤差大、靈敏度低；不能用于定量檢測。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的在于提供一種基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡、制備及檢測方法，本發明制備的試紙卡具有更好的穩定性、更高的靈敏度，同時可通過熒光信號分析快速達到半定量檢測的目的。

基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的試紙卡，包括卡殼和設在卡殼內的試紙條；卡殼包括相互扣合的卡蓋和卡座；試紙條包括底板以及依次搭接粘貼在底板上的吸水墊、檢測墊、結合墊和樣品墊；卡蓋上對應于檢測墊的區域設有視窗，卡蓋上對應于樣品墊的區域設有加樣孔，卡座內設有固定試紙條的卡槽；所述底板為不吸水的PVC板，吸水墊為吸水濾紙；其特征在于：所述檢測墊為設有質控線C和檢測線T的硝酸纖維素膜，質控線C包被His標簽單克隆抗體，檢測線T包被山羊肺炎支原體重組蛋白；所述結合墊為包埋時間分辨熒光微球標記的山羊肺炎支原體重組蛋白的玻璃纖維素膜；所述樣品墊是經樣品墊處理液浸泡處理后干燥的玻璃纖維素膜。

進一步的，所述質控線C和檢測線T是將包被液劃膜于檢測墊制得，其中，His標簽單克隆抗體包被液的濃度是1.2mg/mL，山羊肺炎支原體重組蛋白包被液的濃度為0.6mg/mL。

進一步的，所述時間分辨熒光微球為直徑200 nm的含有高亮稀土染料的羧基聚苯乙烯微球。

進一步的，所述結合墊是將熒光微球-抗原復合物溶液噴至玻璃纖維素膜上制得，所述熒光微球-抗體復合物溶液中，山羊肺炎支原體重組蛋白的標記量是20μL/mL。

進一步的，所述樣品墊處理液為pH 8.0的PBS緩沖液，其中含有的成分及其濃度分別為：質量分數為0.5%的蔗糖，質量分數為0.5%的PVP-K30，質量分數為0.5% 的PEG-20000，體積分數為2%的Tween 20。

本發明還保護制備上述基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的試紙卡的方法，包括以下步驟：

檢測墊的制備：根據質控線C和檢測線T上的包被物，分別制備含有相應包被物的兩種包被液，包被液濃度分別為1.2 mg/mL和0.6 mg/mL，將包被液各自單獨倒吸至劃膜機管線中，在硝酸纖維素膜上均按照0.8μL/cm劃出，完成質控線C和檢測線T上的包被，然后置于37℃鼓風干燥箱中干燥3-4 h，制得檢測墊；

結合墊的制備：將熒光微球分散液置于離心管中；加入MES緩沖液，在超聲條件下混勻，離心棄上清收集微球沉淀，重復此步驟以清洗微球；將微球沉淀溶解于MES緩沖液中，混勻，加入EDC溶液，22-25℃避光活化，離心棄上清，加MES緩沖液，超聲打散微球，離心棄上清；加入硼酸緩沖液，超聲打散，然后加入20μL山羊肺炎支原體重組蛋白混勻，避光反應；加入甘氨酸溶液，避光反應30min，再加入BSA溶液，避光反應30min，完成封閉；離心復溶，以50μl/mL的量加入色素，形成熒光微球-抗原復合物溶液；將熒光微球-抗原復合物溶液噴至玻璃纖維素膜上，干燥，制得結合墊；

樣品墊的制備：將玻璃纖維素膜放入配置好的樣品墊處理液中，浸泡0.5 h，放入37℃鼓風干燥箱中，干燥8-10 h，制得樣品墊；