[發明專利]基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡、制備及檢測方法

在審

• 申請號: 201711220767.5
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107748252A
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 李秀梅;陳小云;任雪建;張志鵬;王俊峰;張小輝;王藍天
• 申請（專利權）人: 洛陽萊普生信息科技有限公司;洛陽現代生物技術研究院有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙)41120
• 代理人: 張隨

1.基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡，包括卡殼和設在卡殼內的試紙條；卡殼包括相互扣合的卡蓋和卡座；試紙條包括底板以及依次搭接粘貼在底板上的吸水墊、檢測墊、結合墊和樣品墊；卡蓋上對應于檢測墊的區域設有視窗，卡蓋上對應于樣品墊的區域設有加樣孔，卡座內設有固定試紙條的卡槽；所述底板為不吸水的PVC板，吸水墊為吸水濾紙；其特征在于：所述檢測墊為設有質控線C和檢測線T的硝酸纖維素膜，質控線C包被His標簽單克隆抗體，檢測線T包被山羊肺炎支原體重組蛋白；所述結合墊為包埋時間分辨熒光微球標記的山羊肺炎支原體重組蛋白的玻璃纖維素膜；所述樣品墊是經樣品墊處理液浸泡處理后干燥的玻璃纖維素膜。

2.如權利要求1所述的基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡，其特征在于：所述質控線C和檢測線T是將包被液劃膜于檢測墊制得，其中，His標簽單克隆抗體包被液的濃度是1.2mg/mL，山羊肺炎支原體重組蛋白包被液的濃度為0.6mg/mL。

3.如權利要求1所述的基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡，其特征在于：所述時間分辨熒光微球為直徑200 nm的含有高亮稀土染料的羧基聚苯乙烯微球。

4.如權利要求1所述的基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡，其特征在于：所述結合墊是將熒光微球-抗原復合物溶液噴至玻璃纖維素膜上制得，所述熒光微球-抗體復合物溶液中，山羊肺炎支原體重組蛋白的標記量是20μL/mL。

5.如權利要求1所述的基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡，其特征在于：所述樣品墊處理液為pH 8.0的PBS緩沖液，其中含有的成分及其濃度分別為：質量分數為0.5%的蔗糖，質量分數為0.5%的PVP-K30，質量分數為0.5% 的PEG-20000，體積分數為2%的Tween 20。

6.制備如權利要求1-5任意一種所述的基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡的方法，包括以下步驟：

檢測墊的制備：根據質控線C和檢測線T上的包被物，分別制備含有相應包被物的兩種包被液，包被液濃度分別為1.2 mg/mL和0.6 mg/mL，將包被液各自單獨倒吸至劃膜機管線中，在硝酸纖維素膜上均按照0.8μL/cm劃出，完成質控線C和檢測線T上的包被，然后置于37℃鼓風干燥箱中干燥3-4 h，制得檢測墊；

結合墊的制備：將熒光微球分散液置于離心管中；加入MES緩沖液，在超聲條件下混勻，離心棄上清收集微球沉淀，重復此步驟以清洗微球；將微球沉淀溶解于MES緩沖液中，混勻，加入EDC溶液，22-25℃避光活化，離心棄上清，加MES緩沖液，超聲打散微球，離心棄上清；加入硼酸緩沖液，超聲打散，然后加入20μL山羊肺炎支原體重組蛋白混勻，避光反應；加入甘氨酸溶液，避光反應30min，再加入BSA溶液，避光反應30min，完成封閉；離心復溶，以50μl/mL的量加入色素，形成熒光微球-抗原復合物溶液；將熒光微球-抗原復合物溶液噴至玻璃纖維素膜上，干燥，制得結合墊；

樣品墊的制備：將玻璃纖維素膜放入配置好的樣品墊處理液中，浸泡0.5 h，放入37℃鼓風干燥箱中，干燥8-10 h，制得樣品墊；

試紙卡的組裝：以PVC板為底板，將樣品墊、結合墊、檢測墊和吸水墊依次搭接粘貼在底板上，每個相鄰處搭接時有1-2mm重疊，并使檢測墊上的檢測線T靠近樣品墊一側、質控線C靠近吸水墊一側，用切條機將貼好的PVC板切成3mm寬的條狀，與卡殼組合并密封保存。

7.如權利要求6所述的制備基于熒光微球的檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的免疫試紙卡的方法，其特征在于：結合墊的制備中，所述色素為胭脂紅、日落黃、檸檬黃、果綠或亮藍。

8.利用如權利要求1-5任意一種所述試紙卡檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一、取出檢測卡，置于平整、潔凈的臺面上；

步驟二、用吸管吸取新鮮采集的羊血清樣品，滴加2-3滴于加樣孔內反應5-10min；

步驟三、按卡蓋上所示箭頭方向將試紙卡插入熒光免疫分析儀的卡槽中，讀取T/C值，進行結果判定；其中，判定標準為：T/C值＜0.1為陰性；T/C值≧0.1為陽性；C值為0，無效。