[發明專利]一種利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型的方法

有效

• 申請號: 201711220061.9
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107988260B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 周明
• 申請（專利權）人: 立沃生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/071
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立;付倩

本發明公開了一種利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型的方法，屬于細胞改造技術領域。其包括如下步驟：步驟1：制備hNTCP重組慢病毒濃縮液；步驟2：制備消化完全的肝組織；步驟3：制備豬原代肝細胞；步驟4：制備豬原代肝細胞單細胞懸液；步驟5：制備鋪板用細胞懸液；步驟6：細胞鋪板與培養；步驟7：對豬原代肝細胞進行hNTCP重組慢病毒感染；步驟8：建立乙肝病毒感染細胞模型。本發明在體外構建含hNTCP基因的重組慢病毒，通過高感染效率的慢病毒將hNTCP基因整合到豬原代肝細胞基因組中，實現hNTCP穩定過表達，使豬原代肝細胞支持乙肝感染。

技術領域

本發明涉及一種利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型的方法，屬于細胞改造技術領域。

背景技術

乙肝病毒(英文縮寫為HBV)感染是中國的“國病”，中國約有9000萬乙肝攜帶者，每年死于乙肝感染相關疾病的人數約一百萬。由于缺乏合適的HBV感染細胞模型，抗HBV藥物的研發相對滯后。盡管乙肝疫苗可以保護健康人免受乙肝侵擾，但對于基數龐大的乙肝攜帶者，目前尚無治愈性藥物。HBV感染細胞模型及動物模型對于抗HBV藥物研發至關重要。

長期以來，抗HBV藥物篩選與評價的細胞模型局限于肝癌細胞系如HepG2、HepG2.2.15、Huh7等等。由于這些細胞系去分化嚴重，與體內肝細胞相比在分化狀態上相差甚遠，所以在篩選與評價抗HBV藥物時不能反映藥物真實的抗病毒效果與細胞毒作用。Na⁺/牛磺膽鹽共轉運多肽(human Na⁺/taurocholate cotransporting polypeptide，hNTCP)被證明是乙肝受體后，基于肝癌細胞系HepG2、Huh7構建了HBV感染細胞模型，在HBV基礎研究及抗HBV藥物研發中發揮著重要作用。但這類細胞系的分化狀態相對較低，且感染效果不理想。

人原代肝細胞由于保持了肝內環境的原始狀態，在抗HBV藥物研發中被公認為“金標準”。人原代肝細胞是HBV研究及抗病毒藥物研發的最佳模型，但人原代肝細胞存在來源有限、批次差異大、醫學倫理問題等缺點，這種細胞并不能在HBV基礎研究及抗HBV藥物研發中被廣泛使用。實驗證實，來自于小鼠和大鼠的肝癌細胞系在過表達hNTCP后仍然不支持HBV感染，說明HBV對人肝細胞的高度嗜性與種屬特異性，其它動物的肝細胞很有可能不支持HBV感染，這形成了一種偏見。

基于豬與人遺傳距離相近、肝臟轉錄組相似性及豬血清流行病學調查，在豬原代肝細胞中過表達hNTCP后極有可能支持HBV感染，從而制備出HBV易感的原代細胞模型及動物感染模型。再者，由于普通轉染試劑如Lipo2000和電轉染，極難實現對原代肝細胞的高效基因操作。而慢病毒可實現對原代肝細胞的高效感染與基因整合表達。但目前，尚未有利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型的方法。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術的不足，提供一種利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型的方法。本發明在體外構建含hNTCP基因的重組慢病毒，通過高感染效率的慢病毒將hNTCP基因整合到豬原代肝細胞基因組中，實現hNTCP穩定過表達，使豬原代肝細胞支持乙肝感染。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型的方法，包括如下步驟：

步驟1：制備hNTCP重組慢病毒濃縮液

利用磷酸鈣轉染法，將慢病毒包裝質粒pCMV dr8.91、慢病毒包裝質粒pMD.2G和hNTCP過表達質粒pWPI-hNTCP-Puro按質量比2:1:3，同時轉染到293T細胞中，轉染后48h收集含慢病毒的培養上清，濃縮后，得到hNTCP重組慢病毒濃縮液；

步驟2：制備消化完全的肝組織

通過兩步膠原酶灌注法，消化分離豬原代肝細胞，得到消化完全的肝組織；