[發明專利]一種利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型的方法

有效

• 申請號: 201711220061.9
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107988260B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 周明
• 申請（專利權）人: 立沃生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/071
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立;付倩

1.一種利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：制備hNTCP重組慢病毒濃縮液

利用磷酸鈣轉染法，將慢病毒包裝質粒pCMV dr8.91、慢病毒包裝質粒pMD.2G和hNTCP過表達質粒pWPI-hNTCP-Puro按質量比2:1:3，同時轉染到293T細胞中，轉染后48h收集含慢病毒的培養上清，濃縮后，得到hNTCP重組慢病毒濃縮液；

其中，所述磷酸鈣轉染法具體為：無菌條件下，向第一個離心管中分別加入450μL去離子水、50μL 2mol/L氯化鈣溶液、10μg慢病毒包裝質粒pCMV dr8.91、5μg慢病毒包裝質粒pMD.2G和15μg hNTCP過表達質粒pWPI-hNTCP-Puro，混勻形成轉染溶液I；在另一個離心管中加入500μL 2×HBS溶液，邊震蕩，邊滴入轉染溶液I，形成轉染溶液II，常溫靜置20min；將轉染溶液II加入到直徑為10cm、細胞融合度70-80％、含有10mL DMEM轉染培養液的293T細胞培養皿中，在37℃、5％CO₂培養箱中培養12h后，將DMEM轉染培養液換成新鮮DMEM培養液，即轉染結束；

所述濃縮的方法為：先將慢病毒上清置于4℃水平離心機中，3800×g/min，離心10min，用0.45μm濾膜過濾后，取15mL過濾液加入到100KD超濾管中，然后再將上述100KD超濾管轉移至4℃水平離心機中，4000×g/min，離心30min后，即得到hNTCP重組慢病毒濃縮液；

步驟2：制備消化完全的肝組織

通過兩步膠原酶灌注法，消化分離豬原代肝細胞，得到消化完全的肝組織；其中，所述兩步膠原酶灌注法，是將新鮮的豬肝組織先通過4℃預冷的灌注溶液I灌注20min，直至肝組織中的血液被沖洗干凈，再用37℃預熱的灌注溶液II灌注30min，直至肝組織失去彈性；

步驟3：制備豬原代肝細胞

將步驟2得到的消化完全的肝組織，轉移至含有細胞洗液的培養皿中，得到豬原代肝細胞細胞懸液；

步驟4：制備豬原代肝細胞單細胞懸液

將步驟3得到的豬原代肝細胞細胞懸液，過細胞篩，得到豬原代肝細胞單細胞懸液；

步驟5：制備鋪板用細胞懸液

將步驟4得到的單細胞懸液離心，用細胞洗液重懸后，再重復離心3次，用鋪板培養液重懸細胞，得到鋪板用細胞懸液；

步驟6：細胞鋪板與培養

將步驟5得到的鋪板用細胞懸液以(1.5-2.5)×10⁵活細胞/cm²的接種密度，接種到膠原包被的培養板或培養皿中，加入鋪板培養液，搖勻，在37℃、5％CO₂培養箱中培養4-6h后，將鋪板培養液換成肝細胞維持培養基PMM，得到培養好的豬原代肝細胞；

步驟7：對豬原代肝細胞進行hNTCP重組慢病毒感染

將步驟1得到的hNTCP重組慢病毒濃縮液，以感染復數為1感染步驟6得到的培養好的豬原代肝細胞，感染孵育24h，換成新鮮的肝細胞維持培養基PMM,每2天換1次，感染后第4天檢測hNTCP蛋白表達，得到hNTCP蛋白過表達的豬原代肝細胞；

步驟8：建立乙肝病毒感染細胞模型

向步驟7得到的hNTCP蛋白過表達的豬原代肝細胞中，先加入乙肝病毒感染阻斷劑，孵育30min后，再以感染復數為1000感染乙肝病毒，感染16-24h后換成新鮮的肝細胞維持培養基PMM，每2天更換1次，感染后第8天檢測乙肝病毒感染指標，即得到所述利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型。

2.根據權利要求1所述的一種利用豬原代肝細胞和hNTCP重組慢病毒建立乙肝病毒感染細胞模型的方法，其特征在于，所述DMEM轉染培養液，為DMEM培養基中加入10％v/v胎牛血清；所述新鮮DMEM培養液，為DMEM培養基中加入100units/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素和10％v/v胎牛血清。