[發明專利]磁微粒化學發光法測定rT3含量的試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201711217127.9
• 申請日: 2017-11-28
• 公開（公告）號: CN108037276A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 魯衡;劉振世;陳海生;李婷婷;李小艷
• 申請（專利權）人: 泰州澤成生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/535
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 黃冠華

1.一種磁微粒化學發光法測定人血清中rT3含量的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括生物素化rT3抗原衍生物、抗體酶標試劑、酶標rT3抗原衍生物、生物素化rT3兔多抗和校準品；

所述試劑盒中主要組分按照如下制備方法制得：

一、rT3抗原衍生物制備過程:

1)、分別配置pH＝5.0的0.05M的MES緩沖液和PH＝9.0的0.1M的NaHCO3緩沖液；

2)、將rT3用MES緩沖液溶解，得到濃度為5mg/ml的rT3溶液；

3)、將EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)用0.05M的MES緩沖液溶解，得到濃度為10mg/ml的EDC緩沖液；

4)、配制終濃度為5mg/ml的PH＝10.0的乙二胺二鹽酸鹽溶液；

5)、將5mg/ml的rT3溶液加入EDC緩沖液300ul，室溫反應3h；

6)、取0.1ml乙二胺二鹽酸鹽溶液加入到步驟5)中的反應完成后的體系中，并混勻，室溫反應1h；

7)、用截留分子量為500的透析袋透析步驟6)中的反應產物，透析緩沖液為PH＝9.0的0.1M的NaHCO3緩沖液；透析后產物收集備用；

二、生物素化rT3抗原衍生物制備過程:

將生物素-NHS用DMSO進行溶解后，按照rT3抗原衍生物與生物素-NHS摩爾比為1:18～22加入步驟一所得的rT3抗原衍生物，充分混勻后室溫反應2h；用透析袋透析反應產物，將透析液稀釋至工作液濃度；

三、抗體酶標試劑制備過程：

將rT3兔多抗體和堿性磷酸酶分別活化后，將二者混合2-8℃反應14～20h小時；將反應物用層析柱進行純化，收集I峰II峰進行混合后用緩沖液將配置成工作液濃度；

四、酶標rT3抗原衍生物制備過程：

將rT3抗原衍生物和堿性磷酸酶分別活化后，將二者混合2-8℃反應14～20h小時；將反應物用層析柱進行純化，收集I峰II峰進行混合后用緩沖液將配置成工作液濃度；

五、生物素化rT3兔多抗制備過程：

1)將生物素-NHS，用DMSO進行溶解得到DMSO溶解的生物素，加入rT3兔多抗，充分混勻后室溫反應2h；透析后將透析液稀釋至工作液濃度。

2.如權利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述步驟三中rT3兔多抗體用0.1*的PBS進行透析，然后用2IT進行活化，得到活化后的抗體；所述步驟四中rT3抗原衍生物采用0.1*的PBS進行透析，然后用2IT進行活化，得到活化后的抗體。

3.如權利要求1或2所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述步驟三和四中的堿性磷酸酶用SMCC進行活化，得到活化后的堿性磷酸酶。

4.如權利要求3所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述校準品的制備方法為：

向0.05M的PH＝7.4的PBS緩沖液中加入5％的BSA和0.1％防腐劑，制得校準品緩沖液；然后將rT3抗原用校準品緩沖液進行稀釋，依次為：2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、50pg/mL和0pg/mL。

5.一種如權利要求1所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)取樣本15ul、生物素化rT3抗原衍生物30ul和抗體酶標試30ul，孵育15min；

2)向1)中加入磁珠30ul，孵育5min；

3)磁分離2min，去上清；

4)洗滌3次，每次300ul洗液；

5)加入底物200ul，測值。

6.一種如權利要求1所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)取樣本15ul、酶標rT3抗原衍生物30ul和生物素化rT3兔多抗30ul，孵育15min

2)向1)中加入磁珠30ul，孵育5min；

3)磁分離2min，去上清；

4)洗滌3次，每次300ul洗液；

5)加入底物200ul，測值。