[發明專利]一種應用大腸桿菌胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法

有效

• 申請號: 201711213274.9
• 申請日: 2017-11-28
• 公開（公告）號: CN107904254B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 胡學軍;丁寧;阮瑤;付鑫;吳凡凡;王莉娟
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/90
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司 21226
• 代理人: 朱秀芬

本發明屬于生物技術領域，具體是一種大腸桿菌胞外生產N?糖基化重組蛋白的方法。本發明方法主要步驟包括構建敲除大腸桿菌外膜脂蛋白Lpp基因的大腸桿菌菌株、引入外源N?糖基化機制到所構建的大腸桿菌中、構建質周腔中表達目的蛋白的載體及自動誘導方式表達目的蛋白，可實現利用大腸桿菌N?糖基化修飾目的蛋白并實現N?糖基化蛋白分泌到胞外。該方法降低了外源基因表達產物在質周腔過度積累所造成的代謝負荷，提高了N?糖基化目的蛋白總產量；無需破碎細菌而從培養基中直接分離純化N?糖基化蛋白，簡化了分離純化步驟，易于大規模工業化生產。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體是一種大腸桿菌胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法。

背景技術

近來應用大腸桿菌原核表達系統來生產糖蛋白日益受到重視。大腸桿菌具有基因組背景清楚、工程菌株構建簡單快速、生長速度快、生產周期短、發酵成本低、產量高、適合大規模工業化生產等優點。目前，可以通過基因工程改造大腸桿菌菌株及將外源N-糖基化機制引入大腸桿菌，使其獲得表達N-糖基化蛋白的能力。主要是將空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)糖基轉移酶pglB及不同來源的糖基轉移酶轉到大腸桿菌體內，使其具有在大腸桿菌質周腔中N-糖基化修飾重組蛋白的能力，在此系統中只有在質周腔中才能實現N-糖基化修飾重組蛋白，所以重組蛋白須通過信號肽引導到質周腔中。而在質周腔中表達重組蛋白，表達量往往遠遠低于在大腸桿菌胞質內表達，所以導致N-糖基化的蛋白總量減少。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種應用基因敲除大腸桿菌外膜脂蛋白Lpp進行胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法，可以顯著提高重組N-糖基化蛋白的表達量，表達的N-糖基化重組蛋白直接分泌到培養基中，無需通過離心收集及再破碎大腸桿菌的方式獲得N-糖基化重組蛋白，簡化N-糖基化蛋白分離純化步驟，顯著降低生產成本。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：

一種應用大腸桿菌胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)大腸桿菌W3110ΔWecAΔLpp菌株構建；

(2)構建大腸桿菌質周腔中表達目的蛋白的載體，結合空腸彎曲桿菌N-糖基化機制，得到能胞外生產N-糖基化重組蛋白的重組大腸桿菌。

(3)步驟(2)中獲得的能胞外生產N-糖基化重組蛋白的重組大腸桿菌在自動誘導培養基中誘導胞外生產N-糖基化重組蛋白。

(4)步驟(3)獲得的重組蛋白純化后即得N-糖基化重組蛋白。

進一步地，步驟(1)是利用Red同源重組方法將大腸桿菌K-12來源的W3110ΔWecA中的外膜脂蛋白Lpp基因敲除，構建大腸桿菌W3110ΔWecAΔLpp菌株。

進一步地，步驟(2)所述空腸彎曲桿菌N-糖基化機制是將來源于空腸彎曲菌中編碼寡糖轉移酶pglB基因(Gene ID:905417)、寡糖合成基因簇以及含有編碼寡糖轉移酶pglB識別序列的目的蛋白基因的質粒轉入大腸桿菌W3110ΔWecAΔLpp菌株中。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明應用一種大腸桿菌敲除菌株W3110ΔWecAΔLpp使N-糖基化重組蛋白分泌到胞外的培養基中，可以提高重組糖蛋白表達水平和降低分離純化成本，無需通過離心收集及再破碎大腸桿菌的方式獲得N-糖基化重組蛋白，簡化N-糖基化蛋白分離純化步驟，提高N-糖基化蛋白總產量，最終有利于N-糖基化藥物蛋白或糖疫苗的大規模生產。

本發明所述應用基因敲除大腸桿菌胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法，可降低目標蛋白的胞內降解，提高重組蛋白表達量；同時減少重組蛋白的胞內過度積累，而降低包涵體形成；消除細胞破壁工藝，減少致熱原污染，方便分離純化，進而降低生產成本。

附圖說明

圖1是rFn3-Gly基因結構圖；