[發明專利]一種應用大腸桿菌胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法

有效

• 申請號: 201711213274.9
• 申請日: 2017-11-28
• 公開（公告）號: CN107904254B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 胡學軍;丁寧;阮瑤;付鑫;吳凡凡;王莉娟
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/90
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司 21226
• 代理人: 朱秀芬

1.一種應用大腸桿菌胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）大腸桿菌W3110ΔWecAΔLpp菌株構建：首先，合成特定的基因打靶片段；打靶片段的兩端為70bp的基因組同源序列，中間是卡那霉素抗性標記序列，將所得的PCR產物切膠回收得到50ng/μL的高濃度打靶片段；然后利用5mmol/L的 L-阿拉伯糖誘導含有敲除輔助質粒pKD46的CLM37大腸桿菌2小時，再將所得的誘導后的菌液制備電感受態細胞；將所得高濃度的基因打靶片段用DpnI酶消化6小時以上，再次切膠回收，導入上述電轉化感受態細胞之中后，在含5mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養基恢復2小時后，使用抗性平板篩選發生同源重組的菌株，并使用鑒定引物lpp - F ：5 ′- catctgcgaacgtaccgaccgcgtgatgaa - 3 ′lpp-R ：5 ′- atgccatacacactgccagcaggctttacg-3′，應用PCR法和測序法進行鑒定；確定基因區域發生替換突變后，再轉化入pCP20質粒以去除卡那霉素抗性片段，即得到Lpp基因敲除的分泌型菌株W3110ΔWecAΔLpp；

（2）構建大腸桿菌質周腔中表達目的蛋白的載體，結合空腸彎曲桿菌N-糖基化機制，得到能胞外生產N-糖基化重組蛋白的重組大腸桿菌：將表達載體pIG6-rFn3-Gly及來源于空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的 N-糖基化基因簇載體的pACYCpgl質粒電擊共轉化大腸桿菌菌株W3110ΔWecAΔLpp菌株，獲得可胞外生產N-糖基化重組蛋白的大腸桿菌菌株；

（3）步驟（2）中獲得的能胞外生產N-糖基化重組蛋白的重組大腸桿菌在自動誘導培養基中誘導胞外生產N-糖基化重組蛋白rFn3-Gly；

（4）步驟（3）獲得的重組蛋白純化后即得N-糖基化重組蛋白。

2.如權利要求1所述的一種應用大腸桿菌胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法，其特征在于，步驟（1）是利用Red同源重組方法將大腸桿菌 K-12來源的W3110ΔWecA中的外膜脂蛋白Lpp基因敲除，構建大腸桿菌W3110ΔWecAΔLpp菌株。

3.如權利要求1所述的一種應用大腸桿菌胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法，其特征在于，步驟（2）所述空腸彎曲桿菌N-糖基化機制是將來源于空腸彎曲菌中編碼寡糖轉移酶pglB基因、寡糖合成基因簇以及含有編碼寡糖轉移酶pglB識別序列的目的蛋白基因的質粒轉入大腸桿菌W3110ΔWecAΔLpp菌株中。

4.如權利要求1所述的一種應用大腸桿菌胞外生產N-糖基化重組蛋白的方法，其特征在于，步驟（3）將轉化子接種到含有氨芐青霉素和氯霉素的LB固體培養基 ,每升培養基中含胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g和15g瓊脂粉平板上，過夜24小時培養；篩選出單克隆后將其接種到含有氨芐青霉素和氯霉素的LB 液體培養基，過夜16小時培養；次日，以1:100接種到10mL含有氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養基的三角瓶中，200rpm、37℃培養，直至OD₆₀₀達到0.6；然后，以 1:100接種到100mL含有氨芐青霉素和氯霉素自動誘導培養基中，在 25℃、200rpm條件誘導表達48小時；在此過程，含有pIG6-rFn3-Gly及pACYCpgl的大腸桿菌 W3110ΔWecAΔLpp菌株胞外生產N-糖基化重組蛋白rFn3-Gly；其中，每升自動誘導培養基中含有以下重量的各組分：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，甘油5g，葡萄糖0.5g，乳糖2g，磷酸氫二鈉7.1g，磷酸二氫鉀6.8g，硫酸銨3.3g，硫酸鈉0.9g，七水硫酸鎂 0.25g。