[發明專利]柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制備及其應用

有效

• 申請號: 201711211436.5
• 申請日: 2017-11-28
• 公開（公告）號: CN109837284B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 鄧秀新;馬兆成;程運江;吳金龍
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C07K14/415;C12N15/70;C12P21/02;C07K1/14;G01N33/68;A23B7/154;C12Q1/18;C12R1/80
• 代理公司: 武漢東喻專利代理事務所(普通合伙) 42224
• 代理人: 紀元

本發明公開了柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制備及其應用，并具體公開了一種密碼子優化的蕓香科植物中非特異性脂轉移蛋白CsLTP3基因，其特征在于，包括SEQ ID NO:2所示的序列。本發明通過抑菌蛋白CsLTP3密碼子優化，原核表達載體構建，rCsLTP3的重組表達、純化及鑒定，得到的rCsLTP3蛋白具備較好的熱穩定性、酸堿穩定性，而且在活體條件下，對柑橘采后綠霉病病原菌指狀青霉菌具有明顯的抑制效果，與現有技術相對，本發明中的植物源抑菌蛋白CsLTP3是一種能夠大規模生產的天然抑菌劑，能夠顯著降低柑橘果實采后綠霉病的發生，且減少化學殺菌劑造成的危害，在柑橘果實防腐保鮮領域具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于柑橘采后綠霉病防治領域，更具體地，涉及一種柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制備及其應用，可應用于防治蕓香科植物果實(如柑橘)采后綠霉病，即利用基因工程制備柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3的方法以及利用該方法制備的提取物作為植物源抑菌劑在諸如柑橘采后病害綠霉病防治中的應用。

背景技術

柑橘是全球第一大水果，在其采收、運輸及貯藏期間，因措施不當導致果實損傷，易遭受多種病原菌的侵染產生采后病害，導致果實腐爛變質，給柑橘產業帶來巨大經濟損失[1]。由指狀青霉(Penicillium Digitatum)和意大利青霉(Penicillium Italicum)引起的柑橘綠霉病和青霉病是柑橘采后的兩大主要病害，導致的腐爛率為70％～80％[2-3]，其中以指狀青霉引起的腐爛尤為嚴重[4]。這種柑橘采后病害主要表現為，果實上病部先發軟，呈水漬狀，2-3天后產生白霉狀物(病原菌的菌絲體)，后中央出現綠色粉狀霉層(病原菌的子實體)，嗅之有悶人的芳香味，很快全果腐爛，果肉發苦，不堪食用。目前控制柑橘采后病害及貯藏保鮮的方法主要是采用化學殺菌劑(如苯并咪唑類、咪唑類、抑霉唑、雙胍鹽類等)結合物理貯藏技術(如低溫、熱處理等)處理果實[5]。雖然化學殺菌劑對柑橘采后病害有一定的控制作用，但其毒性大、環境污染嚴重，給人類健康帶來嚴重威脅，許多化學殺菌劑的使用在很多國家遭到限制。而且由于這些藥劑長期使用使致病菌產生抗藥性，導致采后病害控制方法更加復雜化，影響保鮮效果。因此，尋找一種具有抑制柑橘病原菌活性的植物天然活性物質來控制柑橘采后病害對柑橘產業的發展具有重大意義。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)因具有廣譜的抗細菌活性，高效的抗真菌、病毒和原蟲的活性；熱穩定性好；抗菌機理獨特，不易產生抗藥性等特性，正引起人們的關注，有望成為替代抗生素的產品之一。研究發現抗菌肽廣泛存在于原核生物、植物及動物體內，并在生物的天然防御系統中起著重要的作用。抗菌肽包括抗細菌多肽(antibacterial peptides)和抗真菌多肽(antifungal peptides)[6]。目前，國內對植物源抗菌肽的研究相對較少。有研究報道非特異性脂質轉運蛋白(Non-specific lipidtransfer protein,nsLTP)具備廣泛的抗真菌功能[7]。但未見直接采用非特異性脂質轉運蛋白這類抗菌肽作為植物源抑菌劑在果蔬采后病害防控方面的研發應用報道。參考文獻：

[1]Brown G E,Chambers M.Evaluation of biological products for thecontrol of postharvest diseases of Florida citrus[C]//Proc.Fla.StateHort.Soc.1996,109:278-282.

[2]Demirci F.Effects of'Pseudomonas fluorescens'and'Candida famata'onBlue Mould of Citrus Caused by'Penicillium Italicum'[J].Australian Journal ofCrop Science,2011,5(3):344.

[3]何天富.柑橘學[M].北京:中國農業出版社,1997:714-734.