[發明專利]一種黃芩蛋白納米顆粒及其制備方法

有效

• 申請號: 201711210386.9
• 申請日: 2017-11-28
• 公開（公告）號: CN107840873B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 丁偉;柯李晶;周建武;饒平凡
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;A61K9/14
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供了一種黃芩蛋白納米顆粒及其制備方法，經過分離純化獲得了一個分子量為36.8 kDa、等電點為6.6的黃芩蛋白，該黃芩蛋白的N?端一級結構序列為SAVXSKSPEY。該黃芩蛋白的鹽溶液在蛋白濃度為1 mg/mL，pH7.5條件下，經過80?100℃加熱60 min后，制備得到黃芩蛋白納米顆粒，其平均粒徑為85.6±2.8 nm。黃芩蛋白納米顆粒凍干品流動性佳，復溶性好，易于穩定保存。本發明涉及的黃芩蛋白納米顆粒除安全高效發揮自身功效外，還有望作為載體應用于多種藥物的體內遞送。

技術領域

本發明涉及醫藥技術領域中的蛋白藥物新劑型和制劑技術，具體涉及到一種黃芩蛋白納米顆粒及其制備方法。

背景技術

納米顆粒被大量應用于藥物運輸體系的開發研究中，其中包括金屬聚集體、無機顆粒、超支化聚合物、聚合物膠束等各種不同材料制備的納米藥物載體。各種納米藥物載體有其優點，但也暴露出在生物相容性、細胞毒性和可降解性方面的缺點。經過材料的納米化后，納米材料的物化性質（光學、電學、表面活性等）均會呈現與原始材料截然不同的性質。目前應用于納米藥物載體研究的生物大分子（如血清白蛋白、絲蛋白等）皆沒有可以參照的天然研究模型，獲得納米顆粒的物化性質及其相關生物安全性也需要長期的觀測，才能得到全面評估。納米藥物載體發展帶來的潛在風險引起了科學界廣泛的擔憂。而人民多年服用的湯劑的煎煮過程中自組裝形成的納米顆粒的研究可以解決現階段納米藥物載體研究缺乏研究原型和對安全性擔憂方面的問題。

黃芩在中藥湯劑，特別是中藥復方湯劑中具有非常重要的用途。黃芩性寒、味苦，清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎，可清肺火，藥理作用廣泛；黃芩還具有抗氧化、清除自由基作用、抗腫瘤作用、抗菌抗病毒、抗炎抗過敏作用和對中樞神經系統的保護等生物學效應，其重要的應用價值，不斷引起國內外廣泛研究者的重視。但是到目前為止，有關黃芩蛋白納米顆粒的研究國內外尚未見文獻報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種黃芩蛋白納米顆粒及其制備方法。針對化合物在納米化后，在安全性上的不確定性，本發明涉及的黃芩蛋白納米顆粒的設計從兩個“天然”體系出發：一是天然存在于食品中的蛋白質成分，二是該蛋白質的納米化過程發生在熱加工過程，其納米顆粒存在于各種熬制的“湯”中被廣泛服用。本發明得到的黃芩蛋白納米顆粒體外細胞實驗顯示了其極低毒性，表面規則，粒徑分布均勻，穩定性好等特點。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種黃芩蛋白，其N-端一級結構序列為SEQ ID NO:1：SAVXSKSPEY。

所述的黃芩蛋白分子量為36.8 kDa、等電點為6.6。

一種黃芩蛋白的提取方法，經過磷酸鹽緩沖液水相抽提，離子交換色譜DEAE、High-S，從黃芩中藥飲片中分離得到一個電泳純的黃芩蛋白。

其具體包括以下步驟：

1）黃芩蛋白粗提液的制備：黃芩飲片經高速粉碎機粉碎，以質量比1:10將黃芩粉末和0.1mol/L、pH7.5的磷酸緩沖液混合均勻，置于4℃，攪拌浸提12 h；用3層紗布過濾得到黃芩浸提液，隨后棄去濾渣，將濾液在4 ℃下經12000g離心15min，收集上清液；在4℃磁力攪拌條件下，向黃芩蛋白抽提液中緩慢加入無水硫酸銨，使溶液鹽濃度達到20%，待完全溶解后，4℃下靜置1 h，以12000rpm離心15min，收集上清液；繼續向收集的上清液中緩慢加入無水硫酸銨至飽和度為40%，待完全溶解后，于之前同樣步驟收集上清液；繼續向上清液加入硫酸銨至飽和度為60%，待固體全溶后， 4 ℃下放置1 h，12000rpm離心15 min，收集沉淀。沉淀用0.1 mol/L、pH7.5Tris-鹽酸緩沖液充分溶解后以相同濃度pH7.0Tris-鹽酸緩沖液透析12h，將透析液在12000 rpm，4℃條件下，離心10 min，收集上清液，得到的溶液即為黃芩蛋白粗提液。

2）黃芩蛋白的離子交換色譜二步分離：