[發明專利]一種黃芩蛋白納米顆粒及其制備方法

有效

• 申請號: 201711210386.9
• 申請日: 2017-11-28
• 公開（公告）號: CN107840873B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 丁偉;柯李晶;周建武;饒平凡
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;A61K9/14
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種黃芩蛋白，其特征在于：所述黃芩蛋白的N-端一級結構序列為SAVXSKSPEY；

所述蛋白的制備方法，具體包括以下步驟：

1）黃芩蛋白粗提液的制備：黃芩飲片經高速粉碎機粉碎，以質量比1:10將黃芩粉末和0.1mol/L、pH7.5的磷酸緩沖液混合均勻，置于4℃，攪拌浸提12h；用3層紗布過濾得到黃芩浸提液，隨后棄去濾渣，將濾液在4℃下經12000g離心15min，收集上清液；在4℃磁力攪拌條件下，向上清液中緩慢加入無水硫酸銨，使溶液鹽濃度達到20%，待完全溶解后，4℃下靜置1h，以12000rpm離心15min，收集上清液；繼續向收集的上清液中緩慢加入無水硫酸銨至飽和度為40%，待完全溶解后，于之前同樣步驟收集上清液；繼續向上清液加入硫酸銨至飽和度為60%，待固體全溶后，4 ℃下放置1 h，12000rpm離心15 min，收集沉淀；沉淀用0.1 mol/L、pH7.5Tris-鹽酸緩沖液充分溶解后以相同濃度pH7.0 Tris-鹽酸緩沖液透析12h，將透析液在12000 rpm，4℃條件下，離心10 min，收集上清液，得到的溶液即為黃芩蛋白粗提液；

2）黃芩蛋白離子交換色譜二步分離：

a.將50 mL黃芩蛋白粗提液加至以0.01 mol/L、pH7.0 Tris-鹽酸緩沖液平衡常壓液相弱陰離子交換色譜DEAE色譜柱，以同樣濃度Tris-鹽酸緩沖液繼續平衡3倍柱體積后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.01 mol/L、pH7.0Tris-鹽酸緩沖液線性梯度洗脫250 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L、pH7.0 Tris-鹽酸緩沖液洗脫1個柱體積，流速1 mL/min，紫外分光光度計測量波長為280 nm，經過色譜分離的組分以自動分布收集儀收集，后以SDS-PAGE進行蛋白成分鑒定；

b.將經DEAE分離且透析過的蛋白組分進一步用Macro-Prep? High-S色譜柱進行分離，取60ml經DEAE分離且透析過的蛋白組分加至以0.02 mol/L、pH5.0 Tris-鹽酸緩沖液平衡Macro-Prep? High-S色譜柱，以同樣濃度Tris-鹽酸緩沖液繼續平衡3倍柱體積后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH5.0Tris-鹽酸緩沖液線性梯度洗脫250 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH5.0 Tris-鹽酸緩沖液洗脫1個柱體積，流速1 mL/min，紫外分光光度計測量波長為280 nm，經過色譜分離的組分以自動分布收集儀收集，后以SDS-PAGE進行蛋白成分鑒定；

3）黃芩蛋白的基本性質表征：以SDS-PAGE測定該經純化得到的黃芩蛋白的分子量大小，以等點聚焦測定該黃芩蛋白的等電點，以Edman degradation測定該黃芩蛋白的N-端一級結構序列，所述的黃芩蛋白分子量為36.8kDa、等電點為6.6。

2.一種黃芩蛋白納米顆粒，其特征在于：所述黃芩蛋白納米顆粒由權利要求1中所述黃芩蛋白組成，19個黃芩蛋白單體形成一個類球狀體的蛋白納米顆粒，該納米顆粒其平均粒徑為85.6±2.8 nm，表面電荷呈負性，范圍在-21±3mV。

3.一種如權利要求2所述的一種黃芩蛋白納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括：將該黃芩蛋白配制為1 mg/mL的pH 7.5鹽溶液，經過80-100℃加熱1小時，利用分子截留量為100 kDa的超濾離心管進行超濾去除未反應的黃芩蛋白，即獲得黃芩蛋白納米顆粒。

4.根據權利要求3所述的一種黃芩蛋白納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述的鹽溶液為Tris-鹽酸溶液或磷酸鹽溶液。