[發明專利]高效去除核糖體RNA的構建轉錄組測序文庫的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201711206697.8
• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN107893260B
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 張必良
• 申請（專利權）人: 廣州市銳博生物科技有限公司;廣州銳康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 侯武嬌

本發明公開一種構建轉錄組測序文庫的方法，包括以下步驟：提供包括含有待去除的rRNA的DNA分子；針對待去除的rRNA的DNA序列設計得到的Crispr RNA pool；使DNA樣本與Crispr RNA pool、Crispr蛋白接觸，獲得Crispr系統編輯后的樣本，得到轉錄組測序文庫，以及構建轉錄組測序文庫的試劑盒。本發明所述方式和試劑盒能夠高效去除如rRNA等大量冗余RNA，富集樣本中其他分子，提高了起始轉錄組測序的數據質量和有效數據比例，降低了測序成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體是涉及一種高效去除核糖體RNA的構建轉錄組測序文庫的方法及試劑盒。

背景技術

核糖體RNA(rRNA)構成細胞RNA含量的絕大部分，其占細胞內RNA含量的約80％-95％。高豐度的rRNA使樣本中其他相關的目標分子的分析復雜化，如轉錄組測序(RNA-seq)分析、微陣列的基因表達分析等；尤其在目標分子含量較少的研究中，rRNA成為巨大的背景污染。因此，通常在構建RNA文庫(例如構建轉錄組文庫時)，需要對總RNA進行mRNA(比例約為10％)純化處理。

轉錄組測序能全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在特定狀態下的幾乎所有轉錄本序列信息，是研究基因表達調控的主要手段。轉錄組測序中樣品是來源于細胞和組織中經分離的總RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA、LncRNA和小RNA等。對于轉錄組分析中的目標RNA(mRNA和LncRNA)，rRNA的數據屬于冗余信息，在轉錄組測序中的RNA文庫構建中，首先會進行rRNA的去除，再進行常規的RNA建庫。

現有的用于去除rRNA，進行轉錄組文庫構建的試劑盒，對起始總RNA的要求為100ng-1μg，如Illumina的Stranded Total RNALT-(with Ribo-Zero TM Human/Mouse/Rat)和NEB的NEBNext rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)試劑盒。而對于總RNA起始量為1ng-100ng的樣品，暫未有能有效去除其rRNA、進行轉錄組文庫構建的試劑盒。這一限制可能導致血漿、血清和Exosome等樣品來源的轉錄組測序文庫構建中存在嚴重的rRNA殘留、數據冗余，從而影響后續的mRNA或LncRNA的檢出與分析。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種高效去除核糖體RNA的構建轉錄組測序文庫的方法。

實現上述目的的技術方案如下。

一種構建轉錄組測序文庫的方法，包括以下步驟：

1)提取細胞總RNA，逆轉錄，進行cDNA文庫構建,得到包括含有待去除的rRNA序列信息的cDNA文庫；

2)針對待去除的rRNA的cDNA文庫設計得到Crispr RNA pool；

3)使cDNA文庫樣本與Crispr RNA pool、Crispr蛋白接觸，獲得Crispr系統編輯后的樣本，得到去除了rRNA信息的cDNA文庫。

4)對步驟3)獲得的cDNA文庫進行擴增。

在其中一個實施例中，以1-100ng起始量的細胞的RNA，進行cDNA文庫構建；優選1-10ng起始量的細胞的RNA。

在其中一個實施例中，在rRNA對應的基因組上以50bp/條—500bp/條的設計密度設計Crispr RNA pool中的RNA，優選100-200bp/條的設計密度。所述rRNA選自前體45SrRNA、28SrRNA、18SrRNA、12SrRNA、16SrRNA或其組合。

在其中一個實施例中，Crispr RNA pool是sgRNA pool。

在其中一個實施例中，所述sgRNA如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.133。