[發(fā)明專利]一種高靈敏液晶型非標記免疫傳感器檢測人類β防御素?2的方法

在審

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• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN107918010A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 蘇秀霞;霍文靜;張婧;張姣;徐佳;張蓉;賀生卓;張海寧
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司61202
• 代理人: 劉華

技術領域

本發(fā)明涉及一種人類β防御素-2的檢測方法，具體涉及一種高靈敏液晶型非標記免疫傳感器檢測人類β防御素-2的方法。

背景技術

由于細菌對抗生素耐藥性不斷出現(xiàn)，研發(fā)新型抗生素已迫在眉睫。防御素(defensins)是廣泛存于動植物體內的一類不含糖鏈的堿性陽離子多肽，具有廣譜抗菌的活性，一般由(29～45)個氨基酸殘基組成，是機體防御屏障的重要組成部分。人類防御素是一類陽離子抗微生物肽大家族，分子量為 4~5 k Da，分子內含有 6 個二硫鍵相連的半胱氨酸殘基，是一種具有特殊的空間結構，具有廣泛的殺菌活性、細胞毒性和免疫趨化作用的陽離子多肽，是機體天然防御體系的重要組成部分，并與一些炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)展有密切的關系。人類 β 防御素具有廣譜抗微生物的活性，其作用范圍包括革蘭氏陰、陽性菌、分枝桿菌、真菌及螺旋體等，人類防御素還能夠刺激免疫系統(tǒng)參與免疫反應，提高機體的免疫水平以清除致病微生物，是一種有廣泛應用前景的抗菌肽，可望在抵御細菌、病毒等微生物感染中發(fā)揮重要作用。而這些問題的研究需快速、靈敏、特異、簡便的人類 β 防御素檢測方法。

發(fā)明內容

為了克服現(xiàn)有技術的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種高靈敏液晶型非標記免疫傳感器檢測 HBD-2 的方法。本發(fā)明在檢測人類β防御素-2（HBD-2）含量的過程中引入了高靈敏液晶型非標記免疫傳感器，實現(xiàn)了簡單快速，高效檢測 HBD-2 的目的。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：

一種高靈敏液晶型非標記免疫傳感器檢測 HBD-2 的方法，首先在自組裝膜修飾的基底表面固定 HBD-2 抗體，通過直接免疫反應將HBD-2 抗體結合至傳感器基底表面，從而使基底表面形貌發(fā)生變化，引起液晶分子的排列取向的變化，導致光學圖像信號發(fā)生變化，實現(xiàn)對 HBD-2 的檢測。本發(fā)明包括以下步驟：

1）將玻片切割成 2 cm × 2 cm，用新配制的 Piranha 溶液［V( H₂O₂） : V( H₂SO₄)= 3 : 7 ]于 80 ℃浸泡 1 h，然后用超純水清洗三遍，再在無水乙醇中浸泡 10 min，經 N₂ 吹干，于 110 ℃ 干燥 3 h，防塵備用。

2）玻片的組裝

上玻片用 DMOAP(N,N-二甲基-N-十八烷基(3-[三甲氧基硅烷]丙基)氯化銨) 溶液組裝：將清洗烘烤后的玻片浸 0.2 % (質量分數(shù))的 DMOAP 水溶液中，在常溫下靜置 30 min，用超純水沖洗干凈，N₂ 吹干，于 110 ℃ 干燥 1 h，防塵備用。

下玻片用 APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)和 DMOAP 混合溶液組裝：將清洗烘烤后的玻片浸入（3 % - 5 % ）(質量分數(shù)) APTES 和 1 % (質量分數(shù)) DMOAP 的乙醇溶液中，于 80 ℃ 恒溫 2 h，先用無水乙醇洗兩遍，再用超純水沖洗干凈， N₂ 吹干，于 110 ℃ 干燥 1 h，防塵備用。

3）HBD-2抗體的固定

將氨基化處理的下玻片用質量分數(shù)為（1 % - 3 %）的戊二醛溶液于常溫下浸泡 1 h，超純水洗凈，將 (80 - 120 nmoL/L)的HBD-2抗體溶液加在經醛基化修飾的下玻片上，用洗耳球吹開，于 37 ℃ 溫育 2 h，用 10 mM PBS緩沖液 (pH=7.4) 沖洗，超純水洗凈，N₂ 吹干備用。HBD-2 抗體即可通過戊二醛的偶聯(lián)作用固定在玻片上。

4）HBD-2抗原抗體特異性反應

將一定濃度的 HBD-2 溶液加在固定有 HBD-2 抗體的玻片上，洗耳球吹開，于 37 ℃ 溫育 1 h，抗原抗體即可實現(xiàn)免疫反應。用10 mM PBS (pH=7.4) 緩沖液沖洗后，再用超純水沖洗，N₂ 吹干備用。

5）液晶池的制作

液晶池由上玻片和下玻片面對面組裝而成，玻片之間用 Mylar 聚酯片隔開，Mylar 聚酯片中間開凸型空腔，除開孔方向外，其它三邊邊緣用小夾子固定。 先將液晶 5CB 加熱到 40 ℃左右使其呈各向同性的液態(tài)，然后將其從 Mylar 聚酯片開孔處注入，液晶由于毛細管作用力而布滿整個空腔。自然冷卻到 28 ℃左右用偏光顯微鏡觀察。

所述的步驟1）中酸處理玻片并用無水乙醇浸泡 10 min，使基底表面固定足夠的羥基。