[發(fā)明專利]利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蘆丁水解酶并制備槲皮素的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711199239.6
• 申請日: 2017-11-26
• 公開（公告）號: CN107904220B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔曉東;王轉(zhuǎn)花;杜程
• 申請（專利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/866;C12P17/06
• 代理公司: 山西五維專利事務(wù)所(有限公司) 14105
• 代理人: 張福增

本發(fā)明公開一種利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蘆丁水解酶并制備槲皮素的方法。本發(fā)明利用RT?PCR方法獲得FtRHE基因，與pFastBac Dual載體進(jìn)行連接，獲得重組的pFastBac Dual?FtRHE質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選提取重組Bacmid DNA?FtRHE；將其用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，獲得含F(xiàn)tRHE基因的重組桿狀病毒。將重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞收集上清，經(jīng)Ni柱親和純化獲得蘆丁水解酶。所制備的蘆丁水解酶可將蘆丁專一性的水解為純度達(dá)到98％以上的槲皮素。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)化學(xué)法制備槲皮素耗能大，污染大等缺點，符合低碳經(jīng)濟理念，有較為廣闊的市場前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種來自苦蕎麥的以昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蘆丁水解酶，以及利用該蘆丁水解酶，以蘆丁為底物在體外合成槲皮素的方法。

背景技術(shù)

黃酮類化合物泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物。槲皮素是一種多羥基的天然黃酮類化合物，化學(xué)名為3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮，廣泛存在于多種植物的花、葉和果實中，具有多種生物學(xué)活性和較高的藥用價值。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒作用，能夠清除體內(nèi)自由基、抑制惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等功能，此外還具有擴張動脈、改善腦循環(huán)和抵抗血小板活化因子、降低毛細(xì)血管通透性和脆性等多種生物活性，并且槲皮素具有對人體無毒、無害、無致癌、無致死和無致畸等優(yōu)點。槲皮素對胃癌，乳腺癌，肝癌，宮頸癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，膽囊癌都具有抑制生長的作用，并可以誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。槲皮素通過提高腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性，使腫瘤細(xì)胞停留在對化療敏感的細(xì)胞周期，降低藥物在人體及細(xì)胞內(nèi)的降解速度，提高藥物對腫瘤組織的針對性分布及攝取率，并有助于提高正常組織對藥物副作用的抵抗力。在美國，槲皮素已經(jīng)作為一種治療前列腺癌的非處方藥，在任何藥店均可購買。

盡管天然槲皮素在自然界分布較為廣泛，但在植物體內(nèi)絕大多數(shù)以其糖苷的形式存在，如蘆丁、金絲桃甙和槲皮甙。蘆丁是槲皮素的主要存在形式之一。蘆丁幾乎存在于所有的蕓香科和石楠科植物中，尤以蕓香科植物的蕓香草、豆科植物的槐米、蓼科植物的蕎麥、金絲桃科植物的紅旱蓮、鼠李科植物的光枝勾兒茶、大薊科植物的野梧桐葉等含量較為豐富，可以作為提取蘆丁的原料。蘆丁能降低毛細(xì)血管的通透性、維持血管正常的滲透壓，對保持和恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性有輔助功能。但是蘆丁在抗腫瘤方面幾乎沒有作用。目前，我國蘆丁生產(chǎn)，主要以槐米為原料進(jìn)行提取，其含量可以占到干重10％～28％之間。

工業(yè)上常用蘆丁為原料，以化學(xué)法及生物轉(zhuǎn)化法來生產(chǎn)槲皮素。傳統(tǒng)的化學(xué)法制備槲皮素，即先采用堿提取-酸沉淀法制備蘆丁然后對蘆丁進(jìn)行重結(jié)晶純化，再通過酸水解除去蕓香糖而制得槲皮素。化學(xué)法制備槲皮素，耗時長，環(huán)境污染大。此外也可以采用微生物來轉(zhuǎn)化蘆丁，轉(zhuǎn)化效率不高，并且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為槲皮素和異槲皮素，給產(chǎn)物純化帶來一定難度。此外，也有采用天然提取的蕎麥蘆丁水解酶以蘆丁為底物來制備槲皮素，但是天然的蘆丁水解酶制備困難，含量較少，不宜大規(guī)模使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種來自苦蕎麥的蘆丁水解酶基因，該基因可以在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并利用表達(dá)的酶來生產(chǎn)槲皮素的方法。

本發(fā)明提供的一種蘆丁水解酶基因FtRHE，具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，由1539bp組成，編碼512個氨基酸，屬于β-葡萄糖苷酶家族I成員。

該基因FtRHE通過如下方法獲得：

(1)從開花后20天的云南苦蕎(云蕎1號)幼嫩種子中提取總RNA；