[發明專利]利用昆蟲表達系統生產蘆丁水解酶并制備槲皮素的方法

有效

• 申請號: 201711199239.6
• 申請日: 2017-11-26
• 公開（公告）號: CN107904220B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 崔曉東;王轉花;杜程
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/866;C12P17/06
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 張福增

1.一種蘆丁水解酶，其特征在于，為SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.編碼權利要求1所述的蘆丁水解酶的基因FtRHE，其核苷酸序列為SEQ ID No.2。

3.一種可以在昆蟲細胞中進行高效表達的桿狀病毒，含有權利要求2所述的基因FtRHE。

4.如權利要求3所述的一種可以在昆蟲細胞中進行高效表達的桿狀病毒的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)從開花后20天的苦蕎幼嫩種子中提取總RNA；

(2)將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，用引物CAAAACCATGGCTACTTTTACATCAATGT和ACATTAGTCATGCATCCATGACTGGATCT進行RT-PCR反應，獲得蘆丁水解酶FtRHE基因；

(3)設計新的引物，在上游引物5’端添加BamH I酶切位點，酶切位點之后添加編碼His標簽序列，下游引物3’端添加Not I酶切位點，以該對引物和步驟2獲得的FtRHE基因為模版進行PCR擴增，獲得目的基因；其中所使用的上游引物為：GGATCCATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGATATCCCAACGACCATGGCTACTTTTACATCAATGTCCTTCA，下游引物為：ACATTAGGCGGCCGCTCATTATGCATCCATGACTGGATCT；

(4)把目的基因經Bam HI和Not I雙酶切后與同樣經Bam HI和Not I雙酶切后的pFastBac Dual載體進行連接，獲得重組的pFastBac Dual-FtRHE質粒；

(5)將步驟4獲得的pFastBac Dual-FtRHE質粒，轉化大腸桿菌感受態細胞DH10Bac，經藍白斑篩選，挑取含有重組Bacmid的白色菌落，提取重組Bacmid DNA；

(6)將提取重組Bacmid DNA，用脂質體介導法轉染昆蟲細胞，36-48小時后收集上清，獲得包含FtRHE基因的重組桿狀病毒。

5.一種在昆蟲表達系統中生產蘆丁水解酶的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)將權利要求3所述的桿狀病毒感染昆蟲細胞，28℃培養48-72小時，收集上清，10000g離心去除細胞碎片，得到蘆丁水解酶粗品；

(2)按照每4mL上清加200uL 50％Ni-NTA的比例加入Ni-NTA,200rpm振蕩1-2h；

(3)靜置除去上清液，再加入清洗緩沖液，溫柔混勻清洗緩沖液和Ni-NTA,靜置棄去上清，重復上述步驟兩次；

(4)加入200uL的洗脫緩沖液，溫柔混勻洗脫緩沖液和Ni-NTA，靜置10分鐘，收集上清，重復上述步驟兩次，合并三次得到的上清液，得到純化的蘆丁水解酶。

6.一種利用蘆丁水解酶制備槲皮素的方法，其特征在于步驟如下：

(1)配置濃度10mM/L、pH4-5的醋酸銨緩沖液，其體積分數為70％-80％，乙醇體積分數為20％-30％；

(2)加入底物蘆丁和權利要求5所述方法制備的蘆丁水解酶，在37℃水浴保溫30min，待室溫冷卻并析出黃色物質后，4℃靜置20分鐘，離心，收集沉淀，干燥，得到槲皮素產品。