[發明專利]一種敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201711197149.3
• 申請日: 2017-11-25
• 公開（公告）號: CN109837292A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 曾瀅;楊忠華
• 申請（專利權）人: 深圳賓德生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/867;C12N15/90;C12N5/10;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

本發明提供了一種敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，包括：將靶向EGFR的嵌合抗原受體CAR?EGFR的編碼基因與載體相連，進行重組慢病毒的構建，并轉染CD3陽性T淋巴細胞，將轉染后的T細胞的PD1基因進行敲除，得到敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞。所述敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞敲除了PD1基因，有利于T細胞在患者體內的擴增，避免腫瘤細胞逃脫免疫監視，具有高效且特異性的殺傷腫瘤細胞的性能，并且對正常細胞不會造成損傷，同時人源化單鏈抗體制得的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞能夠更好的維持嵌合抗原受體T細胞的活力和殺傷力。

技術領域

本發明涉及醫學生物領域，特別涉及一種敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應用。

背景技術

人上皮生長因子受體(EGFR)是人上皮生長因子的主要受體。在激活后，EGFR會發生同源二聚，或與其他人上皮生長因子受體家族的成員發生異源二聚，從而誘導EGFR細胞內結構的自磷酸化，并激活下游通路例如絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路等，并介導細胞擴增。研究表明EGFR是一個在肺癌等多種實體瘤細胞中表達或異常表達，而在普通細胞中表達很微弱的細胞表面抗原。EGFR與腫瘤細胞的增殖、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關。在癌癥中，變異的EGFR得到持續性的激活，從而引起細胞無節制的擴增并最終導致癌癥。因此，EGFR是一個癌癥特異性靶點。

程序性死亡蛋白(PD1)是表達于T細胞和前體B細胞膜上的受體蛋白的一種，屬于免疫球蛋白超家族。PD1是免疫檢查點抑制(immune checkpoint in hibition)中的代表性分子，在機體免疫中通過阻止T細胞激活來負向調節免疫反應，以防止自身免疫疾病并保證自體耐受。在腫瘤微環境中，PD1會抑制殺傷性T細胞的活性，從而使腫瘤細胞逃脫免疫監視。

免疫細胞治療是現有科技中唯一有可能徹底清除癌細胞的方法，其治療腫瘤具有特異性強、幾乎無毒副作用的巨大優勢彌補了傳統療法的弊端，在國內外已經用于臨床治療惡性腫瘤，嵌合抗原受體T細胞技術(CAR-T)為當前過繼性細胞回輸治療技術最新的免疫細胞技術之一，因其能夠在體內能激活自身免疫系統，持續性地靶向腫瘤細胞進行殺傷，最終達到清除惡性腫瘤細胞的目的而受到廣泛的關注和研究。目前還未有靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞且可避免腫瘤細胞逃脫免疫監視的研究。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞，所述敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞敲除了PD1基因，有利于T細胞在患者體內的擴增，避免腫瘤細胞逃脫免疫監視，具有高效且特異性的殺傷腫瘤細胞的性能，更好的維持細胞的活力和殺傷力，并且對正常細胞不會造成損傷，同時人源化單鏈抗體制得的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞能夠更好的維持嵌合抗原受體T細胞的活力和殺傷力。

第一方面，本發明提供了一種敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，包括：

(1)提供靶向EGFR的嵌合抗原受體CAR-EGFR的編碼基因，包括從5’端到3’端順次連接的信號肽的編碼基因、靶向EGFR的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區的編碼基因、跨膜區的編碼基因、胞內信號區的編碼基因，其中，所述靶向EGFR的單鏈抗體為人源化單鏈抗體，所述靶向EGFR的單鏈抗體的編碼基因包括編碼如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)將所述CAR-EGFR的編碼基因插入到pWPXLD載體中，得到pWPX LD-CAR-EGFR重組質粒；

(3)包裝所述pWPXLD-CAR-EGFR重組質粒，得到重組慢病毒；

(4)將所述重組慢病毒轉染CD3陽性T淋巴細胞，獲得嵌合抗原受體T細胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因，獲得敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞。