[發明專利]一種敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201711197149.3
• 申請日: 2017-11-25
• 公開（公告）號: CN109837292A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 曾瀅;楊忠華
• 申請（專利權）人: 深圳賓德生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/867;C12N15/90;C12N5/10;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

1.一種敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，包括：

(1)提供靶向EGFR的嵌合抗原受體CAR-EGFR的編碼基因，包括從5’端到3’端順次連接的信號肽的編碼基因、靶向EGFR的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區的編碼基因、跨膜區的編碼基因、胞內信號區的編碼基因，其中，所述靶向EGFR的單鏈抗體為人源化單鏈抗體，所述靶向EGFR的單鏈抗體的編碼基因包括編碼如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)將所述CAR-EGFR的編碼基因插入到pWPXLD載體中，得到pWPX LD-CAR-EGFR重組質粒；

(3)包裝所述pWPXLD-CAR-EGFR重組質粒，得到重組慢病毒；

(4)將所述重組慢病毒轉染CD3陽性T淋巴細胞，獲得嵌合抗原受體T細胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因，獲得敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞。

2.如權利要求1所述的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述胞外鉸鏈區包括CD8α鉸鏈區，所述跨膜區包括CD8跨膜區，所述胞內信號區包括4-1BB信號區和CD3ζ信號區。

3.如權利要求1或2任一項所述的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述靶向EGFR的嵌合抗原受體CAR-EGFR的編碼基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.如權利要求1所述的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述包裝所述pWPXLD-CAR-EGFR重組質粒，得到重組慢病毒包括：

將所述pWPXLD-CAR-EGFR重組質粒與包膜質粒和包裝質粒共同轉染宿主細胞，得到所述重組慢病毒。

5.如權利要求1所述的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因，包括：

將所述Cas9的編碼基因插入至pcDNA3.1載體中，得到pcDNA3.1-Cas9重組質粒，以所述pcDNA3.1-Cas9重組質粒為模板進行體外轉錄得到Cas9mRNA；

合成靶向所述PD1基因的sgRNA對應的基因序列，將所述靶向PD1基因的sgRNA對應的基因序列插入至pcDNA3.1載體中，得到pcDNA3.1-PD1-sgRNA重組質粒，以所述pcDNA3.1-PD1-sgRNA重組質粒為模板進行體外轉錄得到sgRNA；

將所述Cas9mRNA和所述靶向PD1基因的sgRNA與所述嵌合抗原受體T細胞進行混合，并置于電轉儀中進行電轉，敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因。

6.如權利要求5所述的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述靶向所述PD1基因的sgRNA對應的基因序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

7.如權利要求5所述的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述Cas9mRNA和所述靶向PD1基因的sgRNA的質量比為1:1-1:5。

8.如權利要求1-7任一項所述的方法制備得到的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞不含PD1基因，所述敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受體T細胞包括靶向EGFR的嵌合抗原受體CAR-EGFR，所述靶向EGFR的嵌合抗原受體CAR-EGFR包括從氨基端到羧基端順次連接的靶向EGFR的單鏈抗體、胞外鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區的氨基酸序列，其中，所述靶向EGFR的單鏈抗體為人源化單鏈抗體，所述靶向EGFR的單鏈抗體包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。