[發明專利]一種敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201711197132.8
• 申請日: 2017-11-25
• 公開（公告）號: CN109837303A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 張宏玲;龍麗梅
• 申請（專利權）人: 深圳賓德生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

本發明提供了一種敲除PD1的靶向的CD317嵌合抗原受體T細胞的制備方法，包括：將靶向CD317的嵌合抗原受體CAR?CD317的編碼基因與載體相連，進行重組慢病毒的構建，并轉染CD3陽性T淋巴細胞，將轉染后的T細胞的PD1基因進行敲除，得到敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞。所述靶向CD317嵌合抗原受體T細胞敲除了PD1基因，有利于T細胞在患者體內的擴增，避免腫瘤細胞逃脫免疫監視，可以高效且特異性地殺傷CD317陽性腫瘤細胞，持久地維持活力和殺傷力，并且對正常細胞不會造成損傷。

技術領域

本發明涉及醫學生物領域，特別涉及一種敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應用。

背景技術

惡性腫瘤(癌癥)已成為威脅人類生命的元兇，發病率成上升趨勢。CD317是脂筏相關蛋白，主要表達在肝癌、結腸癌等多種實體瘤細胞上，而在普通細胞中幾乎很少表達。CD317的表達往往是細胞對gamma-干擾素通路的應答表現，因此與腫瘤的發生有密切關系。

CAR-T(嵌合抗原受體T細胞)技術是一種新型細胞療法，它是將經過CAR改造的T細胞回輸至人體，激活自身免疫系統，對腫瘤細胞進行殺傷，被認為是目前最有效的惡性腫瘤的治療方式之一。但目前CAR-T技術的應用還局限于血液瘤，對肝癌等多種實體瘤還未有進展。

程序性死亡蛋白(PD1)是免疫檢查點抑制(immune checkpoint inhibition)中的代表性分子，在機體免疫中通過阻止T細胞激活來負向調節免疫反應，以防止自身免疫疾病并保證自體耐受。在腫瘤微環境中，PD1會抑制殺傷性T細胞的活性，從而使腫瘤細胞逃脫免疫監視。目前還未有敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞且可避免腫瘤細胞逃脫免疫監視的研究。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞，所述敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞敲除了PD1基因，有利于T細胞在患者體內的擴增，避免腫瘤細胞逃脫免疫監視，具有高效且特異性的殺傷CD317陽性腫瘤細胞的性能，更好的維持細胞的活力和殺傷力，并且對正常細胞不會造成損傷。

第一方面，本發明提供了一種敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，包括：

(1)提供靶向CD317的嵌合抗原受體CAR-CD317的編碼基因，包括從5’端到3’端順次連接的信號肽的編碼基因、靶向CD317的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區的編碼基因、跨膜區的編碼基因、胞內信號區的編碼基因，其中，所述靶向CD317的單鏈抗體的編碼基因包括編碼如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)將所述CAR-CD317的編碼基因插入到pWPXLD載體中，得到pWPXLD-CAR-CD317重組質粒；

(3)包裝所述pWPXLD-CAR-CD317重組質粒，得到重組慢病毒；

(4)將所述重組慢病毒轉染CD3陽性T淋巴細胞，獲得嵌合抗原受體T細胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因，獲得敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞。

可選的，所述靶向CD317的單鏈抗體的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

可選的，所述靶向CD317的單鏈抗體的氨基酸序列的編碼基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

可選的，所述靶向CD317的單鏈抗體的氨基酸序列的編碼基因應該考慮簡并堿基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的編碼基因包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，保護范圍還應該保護與SEQ ID NO:5具有堿基簡并性質的核苷酸序列，這些核苷酸序列對應的氨基酸序列仍然為SEQ ID NO:1。