[發(fā)明專利]一種敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應用

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• 申請日: 2017-11-25
• 公開（公告）號: CN109837303A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發(fā)明（設計）人: 張宏玲;龍麗梅
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳賓德生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

1.一種敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，包括：

(1)提供靶向CD317的嵌合抗原受體CAR-CD317的編碼基因，包括從5’端到3’端順次連接的信號肽的編碼基因、靶向CD317的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區(qū)的編碼基因、跨膜區(qū)的編碼基因、胞內(nèi)信號區(qū)的編碼基因，其中，所述靶向CD317的單鏈抗體的編碼基因包括編碼如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)將所述CAR-CD317的編碼基因插入到pWPXLD載體中，得到pWPXLD-CAR-CD317重組質(zhì)粒；

(3)包裝所述pWPXLD-CAR-CD317重組質(zhì)粒，得到重組慢病毒；

(4)將所述重組慢病毒轉(zhuǎn)染CD3陽性T淋巴細胞，獲得嵌合抗原受體T細胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因，獲得敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞。

2.如權(quán)利要求1所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述胞外鉸鏈區(qū)包括CD8α鉸鏈區(qū)，所述跨膜區(qū)包括CD8跨膜區(qū)，所述胞內(nèi)信號區(qū)包括4-1BB信號區(qū)和CD3ζ信號區(qū)。

3.如權(quán)利要求1或2所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述靶向CD317的嵌合抗原受體CAR-CD317的編碼基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.如權(quán)利要求1所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因，包括：

將所述Cas9的編碼基因插入至pcDNA3.1載體中，得到pcDNA3.1-cas9重組質(zhì)粒，以所述pcDNA3.1-cas9重組質(zhì)粒為模板進行體外轉(zhuǎn)錄得到Cas9mRNA；

提供靶向PD1基因的sgRNA對應的基因序列；將所述靶向PD1基因的sgRNA對應的基因序列插入至pcDNA3.1載體中，得到pcDNA3.1-PD1-sgRNA重組質(zhì)粒，以所述pcDNA3.1-PD1-sgRNA重組質(zhì)粒為模板進行體外轉(zhuǎn)錄得到sgRNA；

將所述Cas9mRNA和所述靶向PD1基因的sgRNA與所述嵌合抗原受體T細胞進行混合，并置于電轉(zhuǎn)儀中進行電轉(zhuǎn)，完成所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因的敲除。

5.如權(quán)利要求4所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述靶向PD1基因的sgRNA對應的基因序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

6.如權(quán)利要求4所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述Cas9mRNA和所述PD1基因的sgRNA的質(zhì)量比為1:1-1:5。

7.如權(quán)利要求1所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述包裝所述pWPXLD-CAR-CD317重組質(zhì)粒，得到重組慢病毒包括：

將所述pWPXLD-CAR-CD317重組質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染宿主細胞，得到所述重組慢病毒。

8.如權(quán)利要求1-7任一項所述的方法制備得到的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞不含PD1基因，所述敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞包括靶向CD317的嵌合抗原受體CAR-CD317，所述靶向CD317的嵌合抗原受體CAR-CD317包括從氨基端到羧基端順次連接的靶向CD317的單鏈抗體、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)的氨基酸序列，其中，所述靶向CD317的單鏈抗體包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

9.如權(quán)利要求8所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述靶向CD317的嵌合抗原受體CAR-CD317的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

10.一種如權(quán)利要求1-7任一項所述的制備方法制得的或如權(quán)利要求8-9任一項所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受體T細胞在制備預防、診斷和治療惡性腫瘤的藥物中的應用。