[發明專利]一種split-TEV-Fast系統的構建方法及其在檢測蛋白相互作用中的應用

有效

• 申請號: 201711193064.8
• 申請日: 2017-11-24
• 公開（公告）號: CN108048480B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 易犁;王婷;張桂敏;梅萌;王欽宏
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/62;G01N33/68
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立;陳璐

本發明公開了一種基于釀酒酵母的split?TEV?Fast系統方法及其在檢測蛋白互作中的應用，包括：1)構建載體pESD?PPI，其含受半乳糖誘導的一個正向啟動子和一個雙向啟動子，所述正向啟動子用以表達TEV?Fast蛋白酶底物與FLAG和HA標簽序列，所述雙向啟動子用以表達拆分的TEV?Fast蛋白酶和待測目的蛋白；2)用半乳糖同時誘導啟動子，引發下游基因等量表達；3)利用分別識別FLAG和HA標簽序列的熒光抗體對細胞進行標記；4)利用流式細胞儀檢測細胞表面熒光信號，根據單雙熒光信號判斷蛋白之間相互作用的強度。本發明在TEV?Fast蛋白酶及其底物?COOH端使用不同強度的內質網滯留信號肽，可擴大檢測蛋白互作的范圍，并根據最終檢測的單雙熒光信號強度的比例分析蛋白互作的強弱。

技術領域

本發明屬于生物技術和分子生物學技術領域，尤其涉及一種split-TEV-Fast系統的構建方法及其在檢測蛋白-蛋白相互作用中的應用。

背景技術

研究蛋白-蛋白相互作用在諸多生物學領域中都具有極其重要的價值。在生物體內，一種蛋白質通常是與其他蛋白質發生相互作用來進一步執行其功能，是生物信息調控的主要方式，蛋白-蛋白相互作用闡明了整個細胞內的生理生化反應及分子機理，乃至細胞的整個生命過程。目前，驗證蛋白-蛋白相互作用的方法主要包括幾個經典的實驗技術：酵母雙雜交技術，免疫共沉淀技術(Co-IP)，GST pull down技術等等。酵母雙雜交技術的特點在于敏感、高效、操作簡易可大規模的進行驗證，在實際應用當中，由于酵母雙雜交的敏感性而伴隨著一定的假陽性，同時由于反應發生在細胞核內，所以也并非適用于所有的蛋白質，從而可應用Co-IP，GST pull down技術對初篩結果進行進一步的補充，但是Co-IP使用免疫標簽會有假陽性互作，GST pull down需要體外表達純化蛋白，也有一定的局限性。

本發明建立了一種全新的研究蛋白-蛋白相互作用的技術——YeastEndoplasmic reticulum Sequestration based Split-TEV-Fast System(YES-STS,基于酵母內質網滯留的split-TEV-Fast蛋白酶系統)。TEV Protease(Tobacco etch virusprotease)是來源于煙草蝕紋病毒(TEV)的一種半胱氨酸蛋白酶，基于TEV蛋白酶的強底物特異性以及高活性，新近建立起一種可用于研究蛋白間相互作用的Split-TEV蛋白酶系統，引用于：[Wehr MC,Laage R,Bolz U,Fischer TM,Grunewald S,Scheek S,etal.Monitoring regulated protein-protein interactions using split TEV.Naturemethods.2006；3(12):985-93.]。Split-TEV以往所采用的均為野生型的TEV蛋白酶，在待測目的蛋白的相互作用下重新形成完整的TEV蛋白酶只保留其原有活性的40％，并且在細胞質中發揮作用，酶與底物作用空間大，濃度相對較低，造成反應靈敏度低，從而無法對蛋白互作強度進行準確定量。在本發明中，所用的TEV-Fast蛋白酶是經過蛋白酶工程、定向進化得到的一種高于野生型TEV蛋白酶活性接近4倍的突變體，其活性更高，反應更加靈敏，引用于[Yi,L.,Gebhard,M.C.,Li,Q.,Taft,J.M.,Georgiou,G.,and Iverson,B.L.“Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening(YESS)of combinatorial libraries”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2013；110(18):7229-34]。如圖1所示，TEV-Fast蛋白酶從118位被分拆成獨立的-NH₂端和-COOH端結構域，形成-NH₂端(1-118)和-COOH端(119-242)TEV-Fast，-NH₂端和-COOH端TEV-Fast結構域分別以接頭(GGGGSGGGGS或V2R)與待測目的蛋白相連，在待測目的蛋白的相互作用下重新形成完整的TEV-Fast蛋白酶，從而切割底物。由于野生型TEV的活性較低，不足以使該系統發揮其靈敏性，故選用TEV突變體TEV-Fast，保證該系統靈敏高效的特點，這是本發明的第一個創新點。