[發明專利]一種split-TEV-Fast系統的構建方法及其在檢測蛋白相互作用中的應用

有效

• 申請號: 201711193064.8
• 申請日: 2017-11-24
• 公開（公告）號: CN108048480B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 易犁;王婷;張桂敏;梅萌;王欽宏
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/62;G01N33/68
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立;陳璐

1.一種spl it-TEV-Fast系統的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)構建載體pESD-PPI，所述載體pESD-PPI包含均受同一誘導劑誘導的一個正向啟動子和一個雙向啟動子，所述正向啟動子用以表達TEV-Fast蛋白酶的底物多肽和標簽序列的對應的多肽，所述雙向啟動子用以表達拆分的TEV-Fast蛋白酶和待測的目的蛋白；(2)采用誘導劑誘導啟動子，引發下游基因同時進行等量表達；(3)利用FLAG標簽的熒光抗體和HA標簽的熒光抗體對細胞進行熒光標記；(4)利用流式細胞儀檢測細胞表面展示的單雙熒光信號，再根據單雙熒光信號的比例來判斷蛋白與蛋白之間的相互作用的強度；所述步驟(1)中正向啟動子為表達Aga2-FLAG-ENLYFQS-HA-ERS的GAL1，所述雙向啟動子為GAL1-GAL10，分別用以表達拆分的-NH2端TEV-Fast蛋白酶-目的蛋白A和-COOH端TEV-Fast蛋白酶-目的蛋白B，并使拆分的TEV-Fast和目的蛋白之間用接頭連接。

2.根據權利要求1所述的spl it-TEV-Fast系統的構建方法，其特征在于，所述TEV-Fast蛋白酶為TEV蛋白酶的突變體。

3.根據權利要求1所述的spl it-TEV-Fast系統的構建方法，其特征在于，所述標簽序列為FLAG標簽和HA標簽。

4.根據權利要求1所述的spl it-TEV-Fast系統的構建方法，其特征在于，所述ERS為內質網滯留信號肽；所述接頭為GGGGSGGGGS或V2R。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的spl it-TEV-Fast系統的構建方法，其特征在于，在拆分的-COOH端和-NH2端TEV-Fast蛋白酶與目的蛋白融合體的COOH末端都分別加上不同強度的內質網滯留信號肽使得重構的TEV-Fast蛋白酶與底物的酶解反應發生在內質網內，并且作用不同的時間。

6.根據權利要求5所述的spl it-TEV-Fast系統的構建方法，其特征在于，所述步驟(1)和步驟(2)中的誘導劑為半乳糖。

7.根據權利要求6所述的split-TEV-Fast系統的構建方法，其特征在于，所述Aga2為釀酒酵母表面的α凝集素的結合亞單位，可與酵母表面的膜蛋白Aga1以二硫鍵結合展示于酵母表面，其中Aga1為α凝集素核心亞單位，在Aga2蛋白的牽引下，便可將底物多肽序列展示于細胞表面。

8.一種如權利要求1-7中任一項所述方法得到的split-TEV-Fast系統在檢測蛋白是否相互作用和相互作用強度中的應用。