[發(fā)明專利]一種檢測谷胱甘肽探針試劑盒及其檢測方法

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• 申請日: 2017-11-23
• 公開（公告）號: CN107907515A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設計）人: 王穎皓
• 申請（專利權）人: 王穎皓
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/68
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務所(特殊普通合伙)45123
• 代理人: 徐國華

技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域，特別是涉及基于核酸適體熒光探針的谷胱甘肽GSH試劑盒及其檢測方法。

背景技術

谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH)是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。存在于幾乎身體的每一個細胞。谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巰基為其活性基團（故常簡寫為G-SH），易與某些藥物（如撲熱息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子氣，鉛、汞、砷等重金屬）等結合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有廣譜解毒作用，不僅可用于藥物，更可作為功能性食品的基料，在延緩衰老、增強免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應用。

色譜法：氣相色譜―質譜法測定谷胱甘肽。該法可同時測定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多種物質。色譜法靈敏度高、特異性好，但樣品處理、分離條件、色譜柱制備諸多變異，使其難以標準化。而且HPLC設備價格昂貴、技術條件要求高，需專門的維護人員，使其推廣困難。

免疫學法：該法應用特異性的抗S-腺苷谷胱甘肽單克隆技術，采用熒光偏振法或免疫法測定。谷胱甘肽在S腺苷谷胱甘肽水解酶和過量腺苷存在下，被轉換成S腺苷谷胱甘肽;預稀釋的混合物、抗-S-腺苷谷胱甘肽單克隆抗體及標記的熒光S腺苷谷胱甘肽示蹤物一同孵育，儀器自動檢測偏振光的改變，即可測出標本總谷胱甘肽水平。抗體熒光分析法和比濁法不能直接檢測同型半胱胺酸，需一小時以上才能出結果，操作步驟繁瑣。

循環(huán)酶法；是利用酶底物特性，放大靶物質（被測物）的檢測方法。血漿氧化型谷胱甘肽經(jīng)三乙羧乙基膦(TCEP)還原成游離型谷胱甘肽，基于谷胱甘肽甲基轉移酶，S腺苷谷胱甘肽水解酶構成的循環(huán)酶體系以及脫氫酶輔酶體系的原理，分解產(chǎn)物顯色，用自動生化分析儀在600nm波長測OD值得出血漿中的谷胱甘肽的含量。

目前沒有能夠直接識別谷胱甘肽的抗體和其它分子探針。因此設計一種高度設別谷胱甘肽的分子探針，并基于此建立簡單快速和廉價的檢測方法將提高對心腦血管等于谷胱甘肽相關的疾病的的監(jiān)控。

核酸適配體是近年發(fā)展起來的一類新型識別分，是指能夠高特異性和高親和力地域靶分子結的單鏈核苷酸分子。核酸適體可以通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術（Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX）篩選獲得。SELEX 技術是指應用化學法合成大容量的隨機寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機序列組成) 文庫,通過施加選擇壓力(結合靶目標，淘選與靶目標高度特異結合片段的過程), 并結合體外擴增技術, 經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集, 獲得與靶物質高度特異結合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 長度一般為25~ 60 個核苷酸。核酸適體主要通過發(fā)生適應性折疊，通過氫鍵、疏水堆積作用、范德華力與靶分子相互作用，與插入或包被的靶分子形成穩(wěn)定的三維空間結構。核酸適體不與靶分子結合時，核酸適體處于比較松散的結構，5' 和3' 兩端相互游離。與靶分子結合時，靶分子誘導核酸適體結構發(fā)生改變，核酸適體的5' 端和3' 端都將參與與靶分子特定區(qū)域（類似于與抗體結合的抗原位點）的相互作用，導致5' 和3' 兩端相互靠近。這一特點使核酸適體適于分子信標探針設計。其中一種分子信標設計利用了熒光染料芘分子。當一個激發(fā)態(tài)芘分子和另一個基態(tài)芘分子近距離遭遇的時候能形成激發(fā)態(tài)二聚體，能在比芘單體波長更長的位置釋放一個光子。芘激發(fā)態(tài)二聚體發(fā)射峰在 480 到 500nm，而芘單體的發(fā)射峰在 370 到 400nm 之間。另外，芘分子熒光壽命比生物樣品中的非特異激發(fā)熒光的壽命長，檢測時可以在非特異激發(fā)熒光消失后，再來收集激發(fā)態(tài)二聚體的熒光信號，大大提高檢測的特異性和靈敏度。識別谷胱甘肽的核酸適體可以應用于谷胱甘肽的臨床檢測，提高檢測效率，降低檢測成本。

核酸適體與靶物質結合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性, 使其在疾病診斷中具有良好的應用前景, 盡管目前成熟的臨床應用報道較少, 但應用適體檢測靶蛋白的研究卻不斷增多, 基于適體的檢測新技術也不斷出現(xiàn)。核酸適體由于其獨特的化學抗體特性成為新一代針對特定蛋白的分子藥物或靶向載體，以及用于檢測其特異性識別的靶分子物質。但是目前基于核酸適體的針對于谷胱甘肽GSH診斷試劑還很缺乏，且針對于谷胱甘肽GSH的核酸適體熒光探針檢測試劑盒的開發(fā)尚未見有報道。

發(fā)明內容