[發明專利]一種鑒定菊花耐澇性的dCAPS標記開發及應用

有效

• 申請號: 201711176758.0
• 申請日: 2017-11-23
• 公開（公告）號: CN107815502B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 陳發棣;蘇江碩;張飛;種昕冉;宋愛萍;房偉民;陳素梅;蔣甲福
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

本發明涉及一種鑒定菊花耐澇性的dCAPS標記開發方法及應用，屬于生物技術領域，該方法包括以下幾個步驟：a、通過GWAS方法挖掘與菊花耐澇性顯著關聯的SNP位點；b、SNP突變位點特異性酶切位點分析及dCAPS引物設計；c、結合基因型與表型數據預期酶切擴增多態性；d、dCAPS標記在自然耐澇極端群體的驗證；e、在F₁后代耐澇極端群體中對WT?dCAPS1標記進行進一步驗證。本發明開發了一個與菊花耐澇性狀共分離的dCAPS共顯性標記，命名為WT?dCAPS1，在兩個群體的平均鑒定準確率為78.9％，初步認為可以應用于菊花耐澇性分子標記輔助育種，大大縮短育種周期，對于培育耐澇性菊花新品種具有重要的理論和實踐意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種鑒定菊花耐澇性的dCAPS標記開發方法及應用，可用于菊花耐澇性分子標記輔助育種。

背景技術

澇漬是危害世界菊花生產的嚴重自然災害，培育耐澇性菊花新品種是解決這一問題的直接有效方法。因此，開發與菊花耐澇性相關的特異分子標記具有重要意義。目前，RAPD、AFLP、SRAP、ISSR、SSR等傳統的分子標記已經成功應用在菊花種質資源鑒定、遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構建和關聯分析中^[1-5]。隨著現代分子生物學的發展及基因組測序計劃的進行，SNP標記應運而生。SNP(Singie Nucieotide Poiymorphism)，即單核苷酸多態性，是指基因組水平上由單核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，主要包括單個堿基的插入、缺失、轉換和顛倒等。SNP在基因組中分布廣泛、數量多，遺傳穩定性高、遺傳分析重現性好且準確性高，易于快速且高通量地進行基因型分型^[6]。基于以上優點，SNP已經被廣泛地應用于多個物種上的全基因組關聯分析(genome wide association study，GWAS)中^[7-9]。在菊花上，Chong等人^[10]對199份菊花資源利用簡化基因組測序SLAF(specific-locusamplified fragment sequencing)技術，檢測到＞46萬個SNP，并據此分析了菊花的進化關系。

酶切擴增多態性序列(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS)標記是利用特異引物PCR與限制性酶切相結合而產生的一種檢測SNP位點的DNA標記^[11]。其原理是SNP突變位點位于某種內切酶的識別序列上，經過特異引物PCR擴增后，用相應內切酶對PCR產物進行酶切，從而產生酶切片段的多態性，這樣通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色即可顯示。但是SNP恰好位于某種限制性酶切位點的這種情況還比較少，于是Michaels和Amasino^[12]及Neff^[13]在CAPS標記基礎上，開發了人工引入錯配堿基的衍生酶切擴增多態性標記(derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS)，從而幾乎能夠將所有SNP位點轉換成可以電泳檢測的標記。無論是CAPS還是dCAPS，均具有共顯性、位點特異性、操作簡單、檢測快速、成本低廉且不依賴于精密儀器設備等特點，可用于用于植物基因分型、定位、遺傳多樣性分析、品種鑒定等方面。

菊花屬于高度雜合的異源多倍體，復雜的遺傳背景限制了其基因組研究的發展。目前應用在菊花上的分子標記大多為顯性標記，且較難直接應用在菊花育種工作中。此前，本發明人已經公開了一種采用盆栽模擬淹水法模擬菊花澇害處理以及利用隸屬函數法評價菊花耐澇性的專利(106446596A)^[14]；此外本發明人在2016年公開了199份菊花資源的SNP標記^[11]，本專利在以上基礎上，首先利用GWAS檢測到與菊花耐澇性顯著關聯的SNP，據此成功開發了一個共顯性dCAPS標記，并在具有極端耐澇性差異的兩個群體進行驗證，結果表明該標記可以用于指導菊花耐澇性分子標記輔助育種。