[發(fā)明專利]一種鑒定菊花耐澇性的dCAPS標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711176758.0
• 申請(qǐng)日: 2017-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN107815502B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳發(fā)棣;蘇江碩;張飛;種昕冉;宋愛萍;房偉民;陳素梅;蔣甲福
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.一種鑒定菊花耐澇性的dCAPS標(biāo)記的篩選方法，其特征在于包括以下步驟：

a、通過GWAS方法挖掘與菊花耐澇性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)

選取多份來源不同且無直接親緣關(guān)系的菊花品種，采用盆栽模擬淹水法對(duì)該群體進(jìn)行了三次耐澇性鑒定，獲得表型數(shù)據(jù)；基于已有的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)分別采用ADMIXTURE軟件和SPAGeDi軟件對(duì)該群體進(jìn)行分析，獲得群體結(jié)構(gòu)Q矩陣和親緣關(guān)系系數(shù)K矩陣；在TASSEL 5.0軟件中，根據(jù)三次耐澇鑒定試驗(yàn)表型數(shù)據(jù)的平均值，利用GLM和MLM兩種分析模型進(jìn)行全基因關(guān)聯(lián)分析，以兩種模型均能檢測(cè)到的P1E-3的顯著SNP位點(diǎn)為與菊花耐澇性緊密關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，同時(shí)得出該標(biāo)記的貢獻(xiàn)率R²；

b、SNP突變位點(diǎn)特異性酶切位點(diǎn)分析及dCAPS引物設(shè)計(jì)

（1）從步驟a所得的與菊花耐澇性緊密關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)中，選擇P值最小，且貢獻(xiàn)率較大的SNP位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)dCAPS標(biāo)記開發(fā)；

（2）利用在線酶切識(shí)別軟件dCAPS Finder 2.0查找步驟（1）中所選擇的SNP位點(diǎn)突變所引起的限制性內(nèi)切酶信息，選用合適的內(nèi)切酶，且人工引入錯(cuò)配堿基；

（3）利用Primer Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為18-25bp；GC含量40-60%；退火溫度為55℃-65℃，且上下游引物的GC含量和退火溫度盡量保持接近；無引物二聚體及發(fā)卡結(jié)構(gòu)；

步驟b的（1）中選擇的P值最小且貢獻(xiàn)率較大的SNP位點(diǎn)為標(biāo)簽Marker6619的75 bp位置處的SNP位點(diǎn)（Marker6619-75）；

步驟b的（2）中選用識(shí)別序列為GCTAGC的內(nèi)切酶NheI，在Marker6619-74處引入錯(cuò)配堿基（T→C），步驟b的（3）中設(shè)計(jì)的引物序列分別為：

F 5’-ATGCACAAGGCATTGGTCTTGC-3’；

R 5’-CCTCAAAGTTTTGGCTATTCTCC-3’；

標(biāo)簽Marker6619的序列為：

CACCATTTCTTCTTCAGTGGACATTTCCGAACTATCTATTTCTAACGTCTCAATGCACAAGGCATTGGTCTTGT[Y/C]AGCAGCACTAGCAGAAAGACTTGCANNNNNNNNNNTGAATTCTGATGTATTCACAATCTTTAACTTCTTCTGTGGAGAATAGCCAAAACTTTGAGGTAAATTAAATTTGTCTTTATCATATTCATAACCATTTCG；

c、結(jié)合基因型與表型數(shù)據(jù)預(yù)期酶切擴(kuò)增多態(tài)性

對(duì)步驟b中選擇的SNP位點(diǎn)在該群體進(jìn)行基因型分析，對(duì)選擇的SNP位點(diǎn)的基因型分別計(jì)算平均表型值，并用Student’s t檢驗(yàn)方法分析耐澇差異顯著性，結(jié)合基因型與表型值預(yù)期酶切擴(kuò)增多態(tài)性；

d、dCAPS標(biāo)記在自然耐澇極端群體的驗(yàn)證

（1）提取多份耐澇菊花品種材料和多份不耐澇菊花品種材料的基因組DNA，用上述步驟b中設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)耐澇菊花品種材料和不耐澇菊花品種材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段全長；

（2）將擴(kuò)增產(chǎn)物用步驟b中選用的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)、銀染法染色；酶切擴(kuò)增多態(tài)性分析，如果檢測(cè)結(jié)果與步驟c中的預(yù)期相符，則將該SNP位點(diǎn)作為鑒定菊花耐澇性的dCAPS標(biāo)記，將該標(biāo)記命名為WT-dCAPS1標(biāo)記；

e、在F₁后代耐澇極端群體中對(duì)WT-dCAPS1標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證

選取耐澇性菊花品種和不耐澇性菊花品種進(jìn)行雜交，在F₁雜交群體中選擇極端耐澇株系和極端不耐澇株系進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選的WT-dCAPS1標(biāo)記。