[發明專利]一種發現和鑒定肝癌血清差異表達蛋白和驗證標志物蛋白方法

在審

• 申請號: 201711174313.9
• 申請日: 2017-11-22
• 公開（公告）號: CN107894507A
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發明（設計）人: 于思創;王海云
• 申請（專利權）人: 南寧科城匯信息科技有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 南寧指北針知識產權代理事務所(特殊普通合伙)45120
• 代理人: 于勤,林培

技術領域

本發明涉及基因轉錄組學和蛋白質組學領域，尤其是一種發現和鑒定肝癌血清差異表達蛋白和驗證標志物蛋白方法。

背景技術

20世紀原發性肝癌已上升為我國第二位癌癥殺手，在城市僅次于肺癌，在農村則僅次于胃癌^[1]。目前廣西每年有3.5萬人左右死于惡性腫瘤，其中，死于肝癌的有1.2萬人左右，可見，肝癌是廣西第一位癌癥殺手。在廣西范圍內，肝癌危害情況很不均衡。肝癌死亡率較高的縣、市，主要集中于桂西南地區，以南寧周邊的扶綏、隆安、武鳴三縣最為高發，這個局部地區的肝癌發生密度，達到50～60/10萬，其中的個別行政村，肝癌發生密度竟高達140～160/10萬，這樣的肝癌發生率在世界上也是罕見的。肝癌不僅發病率高而且死亡率也高，可謂“癌中之王”，廣西肝癌的死亡率已經上升到27.31/10萬，占全部惡性腫瘤死亡率的34.12％。由于原發性肝癌早期一般無任何癥狀，一旦出現臨床表現，病情大多已進入中、晚期，而且惡性程度高、進展快、預后差、侵襲性強，因此，尋找有效的腫瘤標志物用于癌變機理研究、藥物靶標的設計、疾病的早期診斷及高危人群的篩查成為廣西地區肝癌研究的當務之急。

目前，肝癌的發現和診斷是通過血清AFP檢測結合影像學檢查。其中臨床較為公認的肝癌診斷標準為：血清AFP濃度>400μｇ/L，持續4周，影像學發現肝臟有實質性占位且能排除肝炎活動、生殖胚胎性腫瘤等疾病。但僅依靠血清AFP濃度來診斷肝癌，靈敏度為39%~64%之間，特異度為76%~91%，陽性預測值只在9%～32%，這就使得很多肝癌患者漏檢，或假陽性和假陰性，直接影響肝癌患者的早期診斷和治療。

隨著生物技術的迅猛發展及人類基因組計劃(HGP)全基因組測序的完成，人類進入了后基因組時代，其中蛋白質組學的研究越來越受到人們的關注。用蛋白質組學技術來檢測、分析和確定標志蛋白和靶蛋白，闡明腫瘤蛋白表達水平的變化與腫瘤發生發展不同階段的相互關系及其規律，是目前解決腫瘤早期診斷難題的最有利的途徑；同時，也是腫瘤及其藥物篩選研究中最新并且最強有力的手段。

質譜技術是蛋白組學技術中篩選、鑒定特異性腫瘤標志物的核心，常用的是表面增強激光解析/離子化飛行時間質譜技術（surface-enhanced laserdesorption/inionation-time of flightmass spectrometry，SELDI-TOF-MS）和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）。本課題組曾利用SELDI-TOF-MS結合液質聯用HPLC/MALDI-TOF-MS技術對乙肝相關的肝癌、慢性良性肝病、正常人的血清樣品進行分析，得到人類乙肝相關肝癌的特異性血清標志物NAP2（71）和NAP2（73）。利用與SELDI有著相似的檢測原理但重復性較好的CLINPROT系統，在肝癌與正常人兩組血清樣品中篩選到兩個差異明顯的蛋白質多肽，一個鑒定為來自纖維蛋白原（Fibrinogen）的一個分泌片段，纖維蛋白肽A（Fibrinopeptide A），這與Eduard等的結果完全一致；另一個多肽鑒定為激肽原（Kininogen）。而近兩年來新發展的iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）標記結合MALDI-TOF MS/MSF技術，建立在iTRAQ同位素標記試劑的基礎上，包括一個帶電荷的報告基團，另外還有一個肽段反應基團和一個平衡基團，其中平衡基團平衡分子量，保證與每一種報告基因結合后iTRAQ試劑總的相對分子量都是145，肽段反應基團可以同肽段的N末端和賴氨酸測量E氨基基團發生反應，這樣可以標記生物樣品中產生的所有肽段，增強任一給定蛋白的肽段覆蓋度，同時保留了諸如一些蛋白的翻譯后修飾的重要結構信息，為疾病標志物的發現與鑒定提供了定量信息，使得課題組在肝癌新標志物的篩選方面更為如虎添翼。