[發明專利]一種三疣梭子蟹血細胞分離方法

有效

• 申請號: 201711171477.6
• 申請日: 2017-11-22
• 公開（公告）號: CN108118024B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 周素明;楊寧;王國良;陶震
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 周玨

本發明公開了一種三疣梭子蟹血細胞分離方法，其利用氯化鈉溶液調節PBS緩沖溶液的滲透壓得到的等滲液稀釋碘克沙醇，梯度配置三種不同濃度的碘克沙醇液；采用墊層技術形成不連續密度梯度液，再經靜置形成連續密度梯度液作為細胞分離液；采集三疣梭子蟹血細胞，以等滲液稀釋后得到的混合細胞懸液作為分離對象；取混合細胞懸液緩慢加到細胞分離液上，經離心后三疣梭子蟹血細胞被分成三層，最上層為透明細胞，中間層為小顆粒細胞，最下層為大顆粒細胞；優點是只采用了一步密度梯度離心，不僅操作簡單，而且通過實驗發現分離出來的血細胞的活性好，可用于細胞培養。

技術領域

本發明涉及一種細胞分離技術，尤其是涉及一種三疣梭子蟹血細胞分離方法。

背景技術

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)俗稱白蟹、槍蟹，隸屬于甲殼動物亞門(Crustacea)，軟甲綱(Malacostraca)，十足目(Decapoda)，梭子蟹科(Portunidae)，梭子蟹屬(Portunus)，其廣泛分布于中國、日本、朝鮮及馬來西亞群島等海域，是我國重要的海產經濟蟹類。近年來三疣梭子蟹病害頻發，據統計在各類病害中尤以細菌、病毒及寄生蟲等病原性病害為主，給我國水產養殖業和沿海經濟造成了重大損失。目前，有關海洋甲殼類先天性免疫相關的基礎研究逐漸增多，以加快無脊椎動物疾病免疫防治進程。細胞分離和培養技術在研究動物免疫、疾病的致病機理以及防控中極其重要，然而該技術在海洋無脊椎動物的研究中受到了極大地限制，嚴重阻礙了海洋無脊椎動物免疫功能及相關機制的研究。

甲殼動物的主要免疫組織或者器官為其血淋巴和血細胞，而甲殼動物細胞免疫則主要由血細胞來承擔。目前廣泛認可的一個觀點是：蝦蟹類甲殼動物血細胞具有透明細胞、小顆粒(半顆粒)細胞和大顆粒細胞3大類。其中，透明細胞個體最小，細胞質中幾乎不含有顆粒，主要參與吞噬作用；小顆粒細胞含有小的嗜酸性顆粒，并且參與早期的識別、凝固以及部分的吞噬；大顆粒細胞具有酚氧化酶原系統活性，在受到免疫刺激可以激活酚氧化酶原，同時具有細胞毒性作用。目前，有關蝦類血細胞分離技術已經有了相應的研究。如：段虎等利用Percoll分離液采用兩步密度梯度離心法可將紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)血細胞分離開來。又如：Dantas-Lima等人利用碘克沙醇作為細胞分離液對凡納濱對蝦的血細胞進行分離，發現要將其3種血細胞完全分離開來也同樣需要兩步梯度離心法。目前，國內外尚沒有采用一步密度梯度離心法將3種血細胞完全分離開來的相關技術報道，國內外也尚沒有開展有關蟹類血細胞分離技術的研究。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種三疣梭子蟹血細胞分離方法，其只需一步密度梯度離心就可將三疣梭子蟹的三種血細胞完全分離出來，且分離出來的血細胞的活性好。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種三疣梭子蟹血細胞分離方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟一，細胞分離液的制備：

1_1、配置體積摩爾濃度為0.1M的PBS緩沖溶液；

1_2、利用體積摩爾濃度為3M的氯化鈉溶液調節PBS緩沖溶液的滲透壓為900mOs·mol/kg，得到等滲液；

1_3、將等滲液作為稀釋液，稀釋體積百分濃度為60％的碘克沙醇，梯度配置體積百分濃度分別為10％、15％和20％的三種碘克沙醇液；

1_4、采用墊層技術，將體積百分濃度分別為10％、15％和20％的三種碘克沙醇液依次等量加樣到離心管中，使兩兩之間形成分離面，形成不連續密度梯度液；

1_5、將不連續密度梯度液置于4～6℃溫度環境下靜置12～18小時后，形成連續密度梯度液，將該連續密度梯度液作為細胞分離液；

步驟二，三疣梭子蟹血細胞的采集：

2_1、使用抗凝劑潤洗無菌注射器；