[發明專利]一種三疣梭子蟹血細胞分離方法

有效

• 申請號: 201711171477.6
• 申請日: 2017-11-22
• 公開（公告）號: CN108118024B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 周素明;楊寧;王國良;陶震
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 周玨

1.一種三疣梭子蟹血細胞分離方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟一，細胞分離液的制備：

1_1、配置體積摩爾濃度為0.1M的PBS緩沖溶液；

1_2、利用體積摩爾濃度為3M的氯化鈉溶液調節PBS緩沖溶液的滲透壓為900mOs·mol/kg，得到等滲液；

1_3、將等滲液作為稀釋液，稀釋體積百分濃度為60％的碘克沙醇，梯度配置體積百分濃度分別為10％、15％和20％的三種碘克沙醇液；

1_4、采用墊層技術，將體積百分濃度分別為10％、15％和20％的三種碘克沙醇液依次等量加樣到離心管中，使兩兩之間形成分離面，形成不連續密度梯度液；

1_5、將不連續密度梯度液置于4～6℃溫度環境下靜置12～18小時后，形成連續密度梯度液，將該連續密度梯度液作為細胞分離液；

步驟二，三疣梭子蟹血細胞的采集：

2_1、使用抗凝劑潤洗無菌注射器；

所述的步驟2_1中的抗凝劑為ACD抗凝劑；

2_2、使用潤洗后的無菌注射器，從暫養的三疣梭子蟹的步足關節處抽取血淋巴液，與潤洗后的無菌注射器中預留的抗凝劑1:1混勻，再將混合液置于離心管中；

2_3、在室溫下對混合液進行1000～1200g離心處理2～3min后，去上清，得到細胞沉淀物；

2_4、將步驟1_2得到的等滲液作為細胞懸液，將步驟2_3得到的細胞沉淀物與細胞懸液充分混勻后得到三疣梭子蟹全血細胞懸液；

步驟三，三疣梭子蟹血細胞的分離：

3_1、取三疣梭子蟹全血細胞懸液緩慢加到細胞分離液上，其中，三疣梭子蟹全血細胞懸液與細胞分離液的體積比為1:5～4；

3_2、在4～6℃溫度環境下進行2200～2400g離心處理14～16min后，三疣梭子蟹血細胞被分成三層，最上層為透明細胞層，中間層為小顆粒細胞層，最下層為大顆粒細胞層。

2.根據權利要求1所述的一種三疣梭子蟹血細胞分離方法，其特征在于在所述的步驟3_2后，對分離出的透明細胞層中的透明細胞溶液、小顆粒細胞層中的小顆粒細胞溶液、大顆粒細胞層中的大顆粒細胞溶液進行細胞分離液洗滌，以保持更好的活性，具體過程為：從透明細胞層中吸取出透明細胞溶液，加入體積為吸取出的透明細胞溶液體積的3倍的等滲液，在4～6℃溫度環境下進行1100～1300g離心處理2～3min后，去上清，得到沉淀物；然后在沉淀物中加入體積為沉淀物的體積的3倍的等滲液，在4～6℃溫度環境下進行1100～1300g離心處理2～3min后，去上清，得到洗脫細胞分離液后的透明細胞溶液；以相同的方式，獲取洗脫細胞分離液后的小顆粒細胞溶液和洗脫細胞分離液后的大顆粒細胞溶液。