[發明專利]一種基于代謝途徑改造的生產2-酮基-L-古龍酸的方法

有效

• 申請號: 201711169537.0
• 申請日: 2017-11-22
• 公開（公告）號: CN109810975B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 張怡軒;王彩云
• 申請（專利權）人: 沈陽藥科大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12P7/60
• 代理公司: 沈陽飛揚靈睿知識產權代理事務所(普通合伙) 21255
• 代理人: 靳玲

本發明屬于基因工程和微生物發酵領域，公開了一種基于代謝途徑改造的利用酮古龍酸菌單菌高效生產2?酮基?L?古龍酸(2?KGA)的方法。該方法通過啟動子的篩選，密碼子的優化，構建了一條新穎的糖代謝途徑，從而獲得了一株2?KGA高產菌株。該重組菌株可高效地將L?山梨糖轉化為乙酰輔酶A，從而提高生物量和2?KGA產量。

技術領域

本發明屬于基因工程和微生物發酵領域，涉及一種基于代謝途徑改造的利用酮古龍酸菌單菌高效生產2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)的方法。

背景技術

維生素C(Vitamin C,Vc)，又稱L-抗壞血酸，是人體必需的一種維生素。Vc應用廣泛，常作為抗氧化劑添加于食品、藥品、化妝品中。2-酮基-L-古龍酸作為合成維生素C的前體物質，其合成途徑主要有“萊氏法”和“微生物二步發酵法”。“萊氏法”涉及七步化學反應，其反應過程長，且生產過程中需要大量的危險化學試劑，對環境污染嚴重。微生物二步發酵法是我國研制的具有自主知識產權的微生物發酵方法。該生產工藝包括兩個步驟：第一步是醇糖轉化，是在葡糖酸桿菌的作用下將D-山梨醇轉化為L-山梨糖。第二步是糖酸轉化，是在混菌作用下將L-山梨糖氧化為維生素C的重要中間體2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)。在糖酸轉化過程中，混菌發酵體系主要由酮古龍酸菌和伴生菌組成。酮古龍酸菌含有負責糖酸轉化的全部酶系統，負責將L-山梨糖轉化為2-KGA，而伴生菌既不能利用L-山梨糖作為碳源也不能利用L-山梨糖作為底物，但對酮古龍酸菌的生長起伴生作用。維生素C混菌發酵涉及兩步發酵、三株菌株，其工藝流程長，操作繁瑣，發酵過程易污染，且伴生菌作用機制不清楚。酮古龍酸菌SPU_B003能夠不依賴伴生菌而獨立生長，獨立產酸，具有獨特的生長特性。

糖酵解(EMP)途徑和磷酸戊糖途徑(PPP)作為基礎代謝途徑，廣泛存在于幾乎所有生物中。在EMP途徑中，己糖分解成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下生成乙酰輔酶A，并釋放CO₂。在PPP中，己糖磷酸化形成6-磷酸葡萄糖，隨后在磷酸葡萄糖酸脫氫酶的作用下轉變成5-磷酸核酮糖，并伴隨CO₂的釋放。這兩步脫羧是由己糖生成乙酰輔酶A的過程中造成碳損失的主要反應。

磷酸轉酮酶(XFP,EC 4.1.2.22)是雙歧桿菌糖代謝過程中的關鍵酶，是一個雙底物特異性的酶，能夠接受6-磷酸果糖或5-磷酸木酮糖為底物，催化生成4-磷酸赤蘚糖或3-磷酸甘油醛，并釋放乙酰磷酸。磷酸轉乙酰酶(PTA，EC 2.3.1.8)能夠催化乙酰基團從乙酰磷酸轉移至輔酶A。因此，XFP和PTA共同作用可直接將己糖轉化為化學計量單位的乙酰輔酶A，避免CO₂的釋放，降低碳損失，從而提高己糖利用率。因此，在酮古龍酸菌中構建XFP-PTA糖代謝途徑，該途徑作為EMP，PPP和ED途徑的競爭途徑，能夠降低L-山梨糖在EMP，PPP和ED途徑的流量，使碳流有效地從L-山梨糖流向乙酰輔酶A。細胞內高水平的乙酰輔酶A能促進組氨酸蛋白乙酰化，促進菌的生長和分裂，從而提高生物量和2-KGA產量。XFP-PTA糖代謝途徑并不局限于2-KGA的生產，新的代謝途徑在以己糖為碳源的發酵過程中具有廣泛的應用價值。

發明內容

本發明的目的在于：針對維生素C發酵過程中工藝流程長，操作繁瑣，發酵過程易污染，且伴生菌作用機制不清楚的問題，提供一種利用酮古龍酸菌單菌高效生產2-KGA的方法。

本發明提供的高效合成2-KGA的方法，可通過如下技術方案實現：

首先通過網站預測啟動子，然后利用綠色熒光蛋白基因作為報告基因篩選內源性啟動子，最后通過基因工程技術改造酮古龍酸菌，構建高效合成乙酰輔酶A的新穎的糖代謝途徑，以減少由L-山梨糖生成乙酰輔酶A過程中CO₂的釋放，提高碳的利用率，使L-山梨糖有效地生成2-KGA。

即包括如下步驟：

(1)篩選酮古龍酸菌內源性啟動子；

(2)在酮古龍酸菌中構建XFP-PTA糖代謝途徑；