[發明專利]一種櫻桃砧木PcWRKY71基因及其克隆方法

在審

• 申請號: 201711165355.6
• 申請日: 2017-11-21
• 公開（公告）號: CN107841504A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 徐麗;陳新;宋曉娟;朱東姿;魏海蓉;劉慶忠
• 申請（專利權）人: 山東省果樹研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 青島華慧澤專利代理事務所(普通合伙)37247
• 代理人: 劉娜,沙莎

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別涉及一種櫻桃砧木PcWRKY71基因及其克隆方法。

背景技術

干旱和鹽堿等非生物脅迫是影響植物生長發育的主要限制因素。為適應這些非生物脅迫，植物在分子水平上進化形成了相應的機制，誘導脅迫相關轉錄因子的表達。因為轉錄因子能通過參與不同的復雜的信號通路，調控植物的生理生化活動來抵御逆境。

WRKY是目前研究較為廣泛的一類植物特有轉錄因子，存在1個或2個高度保守的WRKYGQK結構域，緊隨其后的一段鋅指結構。WRKY家族成員被證實能響應植物對干旱和鹽的脅迫。研究表明擬南芥和水稻中分別有74和126個家族成員，而在綠藻中僅有一個成員。Zhou等把大豆GmWRKY13和GmWRKY54分別轉到擬南芥中，過量表達GmWRKY54的植株對干旱和鹽害都具有一定的忍耐性，而過量表達GmWRKY13的植株對鹽害和甘露醇脅迫敏感。過表達AtWRKY25和AtWRKY33能夠通過影響SOS(salt overly sensitive)通路來提高擬南芥對高鹽環境的耐受性。Song等用PEG，NaCl和ABA處理轉OsWRKY08基因的擬南芥，發現OsWRKY08基因表達量增加，改善了轉基因擬南芥滲透調節能力。相似的ZmWRKY33受高鹽、干旱、低溫和ABA誘導表達，且轉基因擬南芥的耐鹽性提高。Sun等研究表明二穗短柄草BdWRKY36能提高轉基因煙草耐受干旱的能力。棉花的GhWRKY17在受干旱、高鹽處理的誘導后大量表達。

WRKY轉錄因子廣泛參與植物的生長、發育、衰老等進程，對各種生物脅迫和非生物脅迫都有一定響應。但是關于WRKY轉錄因子的研究多集中于擬南芥和煙草等模式植物中，而櫻桃轉錄因子的相關研究還未見報道。

由于甜櫻桃性喜溫、不耐寒、不耐鹽堿，所以其分布和栽培區域受到限制，因此種植櫻桃除選擇抗逆性強的品種，還要選擇合適的具有抗性的砧木。櫻桃砧木在櫻桃生產中起著非常重要的作用，因此改善砧木抗逆性迫在眉睫。通過常規育種獲得新品種周期較長，而通過基因工程獲得抗逆新品種日益受到重視，其中關鍵基因的挖掘是前提。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種櫻桃砧木PcWRKY71基因及其克隆方法，以達到櫻桃的分子育種提供基因資源的目的。

為達到上述目的，本發明的技術方案如下：

一種櫻桃砧木PcWRKY71基因，為從櫻桃砧木中克隆得到的WRKY基因，命名為PcWRKY71，其cDNA全長1014bp，cDNA序列為SEQ ID NO.1；其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2，核苷酸序列中含有1個WRKY保守結構域和1個C₂H₂的鋅指基序，屬于WRKY基因家族第Ⅱ類成員。

上述方案中，所述PcWRKY71基因分子量為37.41kDa，等電點為6.72，不穩定系數為57.13，屬于不穩定蛋白。

一種櫻桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，包括如下步驟：

(1)RNA的提取：采用Trizol一步法提取吉塞拉6(‘Gisela 6’)櫻桃苗葉片總RNA；

(2)cDNA的合成：以提取的總RNA為模板，進行RT-PCR反轉錄，得到cDNA第一鏈；

(3)PcWRKY71基因的克隆：設計一對引物PcWRKY71-F和PcWRKY71-R，序列分別見SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以反轉錄cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，獲得PcWRKY71全長cDNA序列。

上述方案中，所述步驟(1)中，RNA的提取具體方法如下：稱取吉塞拉6櫻桃苗葉片0.2g，于液氮中研磨成粉末，向研缽中加入2m L TRizol充分勻漿，室溫放置10min；勻漿吸入1.5mL的離心管中，加入200μL的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管，室溫放置10min；4℃離心，12000r/min，15min，取上層液相移入另一管；加入500μL等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min；4℃離心，12000r/min，15min，用槍小心吸去所有上清；1mL 75％乙醇洗兩遍，離心4℃，8000r/min，10min，用槍小心吸去所有上清，在超凈臺中干燥5min；加入適量DEPC處理水，65℃促溶10-15min，保存在-80℃備用。