[發(fā)明專利]一種櫻桃砧木PcWRKY71基因及其克隆方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711165355.6
• 申請(qǐng)日: 2017-11-21
• 公開（公告）號(hào): CN107841504A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐麗;陳新;宋曉娟;朱東姿;魏海蓉;劉慶忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省果樹研究所
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 青島華慧澤專利代理事務(wù)所(普通合伙)37247
• 代理人: 劉娜,沙莎

1.一種櫻桃砧木PcWRKY71基因，其特征在于，為從櫻桃砧木中克隆得到的WRKY基因，命名為PcWRKY71，其cDNA全長(zhǎng)1 014bp，cDNA序列為SEQ ID NO.1；其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2，核苷酸序列中含有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C₂H₂的鋅指基序，屬于WRKY基因家族第Ⅱ類成員。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種櫻桃砧木PcWRKY71基因，其特征在于，所述PcWRKY71基因分子量為37.41kDa，等電點(diǎn)為6.72，不穩(wěn)定系數(shù)為57.13，屬于不穩(wěn)定蛋白。

3.一種如權(quán)利要求1所述的櫻桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)RNA的提?。翰捎肨rizol一步法提取吉塞拉6櫻桃苗葉片總RNA；

(2)cDNA的合成：以提取的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈；

(3)PcWRKY71基因的克隆：設(shè)計(jì)一對(duì)引物PcWRKY71-F和PcWRKY71-R，序列分別見(jiàn)SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PcWRKY71全長(zhǎng)cDNA序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種櫻桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，所述步驟(1)中，RNA的提取具體方法如下：稱取吉塞拉6櫻桃苗葉片0.2g，于液氮中研磨成粉末，向研缽中加入2m L TRizol充分勻漿，室溫放置10min；勻漿吸入1.5mL的離心管中，加入200μL的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管，室溫放置10min；4℃離心，12000r/min，15min，取上層液相移入另一管；加入500μL等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min；4℃離心，12000r/min，15min，用槍小心吸去所有上清；1mL 75％乙醇洗兩遍，離心4℃，8000r/min，10min，用槍小心吸去所有上清，在超凈臺(tái)中干燥5min；加入適量DEPC處理水，65℃促溶10-15min，保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種櫻桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，所述步驟(2)中，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中含有總RNA 2μg，2×TS Reation Mix 10μL，隨機(jī)引物2pmol，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1μL，加ddH2O至20μL，混勻；42℃孵育30min，冰上冷卻2min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種櫻桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，所述步驟(3)中，PCR擴(kuò)增體系為50μL，在0.2mlPCR管中分別加入以下成分：PcWRKY71-F(10μM)1μL，PcWRKY71-R(10μM)1μL，5×TransStart FastPfu Buffer 10μL，2.5mM dNTPs 5μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶1μL，模板2μL，加ddH2O至50μL，混勻。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種櫻桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，所述步驟(3)中，PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。