[發明專利]用于鑒定西藏米拉山地區大花紅景天的特異引物及鑒定方法

有效

• 申請號: 201711161778.0
• 申請日: 2017-11-21
• 公開（公告）號: CN107653340B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 劉志偉
• 申請（專利權）人: 劉志偉
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明公開了一對用于西藏米拉山地區大花紅景天鑒定的特異引物序列和鑒定方法，引物序列由5’TCCGTTGCTGAATGTCTGTC3’和5’ATCAAGCATGATTGTTGCGT3’組成。使用上述引物鑒定西藏米拉山地區大花紅景天的方法包括4個步驟：（1）五種不同西藏海拔地區大花紅景天基因組DNA提取；（2）特異引物對的PCR擴增；（3）PCR產物的凝膠電泳檢測；（4）結果判讀：依照標準DNA marker帶在凝膠上的位置鑒定是否為西藏米拉山地區的大花紅景天。采用上述方法鑒定的結果與種植區吻合率達95%以上。該方法在西藏米拉山地區大花紅景天鑒定上具有重要的應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術中的鑒定西藏米拉山地區大花紅景天的引物序列及其利用該引物序列鑒定米拉山地區大花紅景天的方法。

背景技術

大花紅景天（Rhodiola crenuLata）是被子植物門（Angiospermae），雙子葉植物綱（Dicotyledoneae），薔薇目（Rosales），景天科(CrassuLaceae)紅景天屬(Rhodiola L.)植物。紅景天是多年生的草本植物，一般生長在海拔為3500-5000m的高寒、低溫、強紫外線的山區，國內外許多的藥理研究表明，紅景天在抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗氧化、安眠鎮靜及生理調節等方面均具有獨特的功效，被廣泛的應用于保健品、藥品、化妝品等領域。

紅景天全世界大約有90種，主要的分布地帶為北半球高寒的地帶。能在特別惡劣的環境下生長，如強紫外線照射、低溫干燥、晝夜溫差大、極度缺氧等，大多為天然資源。在青藏地區的高寒山區，如西藏、新疆等地均有分布。西藏不同海拔地區大花紅景天在外觀差別不大，但在生化以及分子層面上有著很多差異。為了更準確簡便的鑒定西藏米拉山地區的大花紅景天，以SSR分子篩選作為基礎，并根據其兩端的序列來設計引物，在較高的退火溫度下，進行特異性的擴增，從而實現由SSR分子標記到SCAR標記的轉換，對西藏米拉山地區大花紅景天的進行特異的檢測。

西藏不同地區大花紅景天的化學成分有著很大的差異，目前關于西藏不同地區大花紅景天的研究大多基于分析某種化學成分的差異以及對于遺傳多樣性的考查，經過大量文獻的閱讀，并無發現有關西藏米拉山地區大花紅景天檢測的報道。

西藏米拉山地區大花紅景天的鑒定填補了大花紅景天不同海拔地區鑒定領域的空白。隨著分子生物學技術的發展，特別是DNA分子標記技術的發展可以為這些研究提供準確、快捷的輔助手段。由于DNA分子標記不存在表達與否的問題，可以直接以DNA的形式表現，在植物體的各個組織、各發育時期均可檢測，不受取材部位、時間、發育時期和環境的影響，信息量大，準確率高，為米拉山地區大花紅景天品種的早期篩選帶來廣闊的應用前景。

發明內容

本發明的目的是篩選鑒定西藏不同海拔地區大花紅景天的分子鑒定方法，克服以往形態識別的不足。提供快速篩選米拉山地區大花紅景天的引物序列。

本發明的技術方案概述如下：

一種鑒定米拉山地區大花紅景天的引物序列，它由引物序列：5’TCCGTTGCTGAATGTCTGTC3’和5’ATCAAGCATGATTGTTGCGT3’組成。其引物序列為：SEQ ID No1-2。

本發明進一步公開了使用特異引物序列鑒定西藏米拉山地區大花紅景天品種的方法，它包括如下步驟：

（1）五種不同西藏海拔地區大花紅景天基因組DNA提取；

（2）PCR擴增；在PCR專用薄壁離心管中加入：PCR緩沖溶液；10mmol/L dNTPs；10μmol/L上游引物序列：TCCGTTGCTGAATGTCTGTC ，以及10μmol/L下游引物序列：ATCAAGCATGATTGTTGCGT；大花紅景天基因組DNA 50- 100ng；10mmol/L dNTPs；PCR緩沖溶液2.5微升；10μmol/LTaq聚合酶2單位；無菌水補至25微升；