[發明專利]一種雞成骨細胞體外分離培養方法

在審

• 申請號: 201711161552.0
• 申請日: 2017-11-21
• 公開（公告）號: CN107699542A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 郭雙雙;李葉涵;丁斌鷹;侯永清;易丹
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司11614
• 代理人: 高爽

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，涉及一種雞成骨細胞體外分離培養方法。

背景技術

成骨細胞是間質來源細胞，具有強大的分泌功能，骨基質成分幾乎都由成骨細胞分泌。作為骨形成和發育過程中的一種重要功能細胞，成骨細胞是骨組織修復和骨質疏松等領域的研究熱點。自1964年首次成功分離新生大鼠成骨細胞至今，采用人和動物的正常骨或骨肉瘤組織培養了許多成骨樣細胞培養體系。雖然來源于骨肉瘤的細胞系常用于研究，但是它具有腫瘤細胞的特點，與正常成骨細胞在基本結構、代謝和功能特性等方面存在一定的差異，無法真實反應體內正常的生物學特點。

與骨肉瘤細胞系相比，原代培養的成骨細胞更接近正常生理水平。成骨細胞的原代培養方法主要有酶消化法(程浩等，新生大鼠成骨細胞原代培養與鑒定，中國組織工程研究，2013，17(41)，7199-7204)和組織塊貼壁法(CN105505862A)，而且主要取材于大鼠。不同于大鼠等胎生動物，雞是卵生動物，它的成骨細胞可能具有特異的生物學特點。從孵化的雞胚取材，分離原代的成骨細胞更加簡單方便。此外，雞胚成骨細胞是探究雞的骨骼發育、代謝和骨質疏松等疾病的重要研究對象。

目前，雞的原代成骨細胞分離通常采用酶消化法，主要有兩種，一種是用胰蛋白酶和膠原酶混合酶液反復消化5次，取第2-5次的消化液收集細胞(Yao et al.,Effects of ipriflavone on caged layer bone metabolism in vitro and in vivo,Poultry Science,2007,86,503-507.)，該方法通常細胞得率非常低，步驟繁瑣。另一種方法是先用胰蛋白酶消化顱骨，再用膠原酶消化顱骨組織塊(江莎等，雞骨鈣素蛋白的原核表達及其生物學活性，南京農業大學學報，2013，36(6)，60-66；Chen et al.,17β-estradiol combined with testosterone promotes chicken osteoblast proliferation and differentiation by accelerating the cell cycle and inhibiting apoptosis in vitro,Veterinary Research Communications,2010,34,143-152.)，這種方法細胞得率高，但是忽略了細胞純化的步驟，細胞的純度非常低。成骨細胞屬于成纖維細胞樣的細胞，容易受到成纖維細胞的污染，需要用適當的方法去除成纖維細胞，并從理化特性上鑒定區分成骨細胞和成纖維細胞。

因此，有必要開發一種操作過程簡便、細胞得率和純度高、生長迅速的雞成骨細胞分離培養方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述缺陷，開發一種操作過程簡便、細胞得率和純度高、生長迅速、狀態良好的雞成骨細胞體外分離培養方法。

為了實現上述目的，本發明提供一種雞成骨細胞體外分離培養方法，該方法包括以下步驟：

(1)選用15-16胚齡的種蛋，無菌條件下取雞胚的顱骨，剝離結締組織，刮除骨膜直至顱骨發白，用含有抗生素的緩沖溶液洗滌；胚齡的選擇很關鍵，過早顱骨還沒有形成，過晚成骨細胞的分化能力較差；

(2)將洗滌后的顱骨置于胰蛋白酶溶液中，于37℃培養箱中孵育，棄去消化液，用緩沖溶液洗滌；

(3)將步驟(2)處理后的顱骨剪成0.8-1.2mm³的組織塊，并轉移至離心管中，加入II型膠原酶溶液，于37℃培養箱中孵育；

(4)用含有胎牛血清的培養基終止消化，使未消化的大塊骨組織沉降，取消化液；

(5)將所述消化液離心棄去上清液，用含有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的培養基重懸沉淀物，混勻后移入T25細胞培養瓶中；

(6)采用差速貼壁的方法去除成纖維細胞，在37℃、5％CO₂培養箱中培養25-35min后，棄去貼壁的成纖維細胞，將未貼壁的細胞懸液轉移至另一T25細胞培養瓶中，置于培養箱中培養；25-35min的培養時間很關鍵，時間過短無法去除成纖維細胞，時間過長成骨細胞也會被除去；

(7)定期更換培養液，待原代成骨細胞長滿，用胰蛋白酶消化，差速貼壁純化后傳代。

根據本發明一種優選實施方式，步驟(1)中，所述抗生素為青霉素和鏈霉素；所述青霉素的濃度為90-110U/mL，所述鏈霉素的濃度為90-110μg/mL，體積為1.5-3mL；所述緩沖溶液為PBS緩沖液。