[發(fā)明專利]一種雞成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法

在審

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• 申請日: 2017-11-21
• 公開（公告）號: CN107699542A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭雙雙;李葉涵;丁斌鷹;侯永清;易丹
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢輕工大學(xué)
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京思創(chuàng)大成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11614
• 代理人: 高爽

1.一種雞成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)選用15-16胚齡的種蛋，無菌條件下取雞胚的顱骨，剝離結(jié)締組織，刮除骨膜直至顱骨發(fā)白，用含有抗生素的緩沖溶液洗滌；

(2)將洗滌后的顱骨置于胰蛋白酶溶液中，于37℃培養(yǎng)箱中孵育，棄去消化液，用緩沖溶液洗滌；

(3)將步驟(2)處理后的顱骨剪成0.8-1.2mm³的組織塊，并轉(zhuǎn)移至離心管中，加入II型膠原酶溶液，于37℃培養(yǎng)箱中孵育；

(4)用含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，使未消化的大塊骨組織沉降，取消化液；

(5)將所述消化液離心棄去上清液，用含有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基重懸沉淀物，混勻后移入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；

(6)采用差速貼壁的方法去除成纖維細(xì)胞，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25-35min后，棄去貼壁的成纖維細(xì)胞，將未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(7)定期更換培養(yǎng)液，待原代成骨細(xì)胞長滿，用胰蛋白酶消化，差速貼壁純化后傳代。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法，其中，步驟(1)中，所述抗生素為青霉素和鏈霉素；所述青霉素的濃度為90-110U/mL，所述鏈霉素的濃度為90-110μg/mL；所述緩沖溶液為PBS緩沖液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法，其中，步驟(2)中，所述胰蛋白酶溶液的濃度為0.25-0.5％，體積為1.5-3mL；所述孵育的時間為10-20min；所述緩沖溶液為PBS緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法，其中，步驟(3)中，所述II型膠原酶溶液的濃度為0.8-1.2g/L；所述孵育的時間為40-60min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法，其中，步驟(4)中，所述胎牛血清的濃度為10-15％；所述培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法，其中，步驟(5)中，所述胎牛血清的濃度為10-15％；所述青霉素的濃度為80-120U/mL；所述鏈霉素的濃度為80-120μg/mL；所述培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法，其中，步驟(7)中，所述胰蛋白酶的濃度為0.25-0.5％。